TWEAK及其受體Fn14在乳腺癌中的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系.pdf

1、目的:TWEAK(TNF-relatedweakinducerofapoptosis)是腫瘤壞死因子配體超家族成員之一，為Ⅱ型跨膜蛋白，可水解產(chǎn)生一個(gè)分子量為18kDa可溶性的活性蛋白。TWEAK具有多種生物學(xué)功能：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞殺傷活性、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌及參與血管形成。Fn14(fibroblastgrowthfactor-inducible14)是TWEAK的受體之一，為Ⅰ型跨膜蛋白，可通過(guò)連接不同的含有TRA

2、F(TNFreceptor-associatedFactor)結(jié)構(gòu)域的受體蛋白或胞漿蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引發(fā)相應(yīng)的基因活化。TWEAK/Fn14信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與許多病理疾病的發(fā)生，但其確切機(jī)制至今不清，同時(shí)TWEAK在人類多種正常組織和非淋巴性腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)較低，而在多種腫瘤中表達(dá)則明顯高于其來(lái)源正常的組織，F(xiàn)n14在腫瘤組織表達(dá)也高于正常組織，這種表達(dá)改變的普遍性及其對(duì)于腫瘤預(yù)后評(píng)估的意義尚有待于進(jìn)一步的探討。

3、 目前關(guān)于TWEAK及其受體Fn14在腫瘤組織中的表達(dá)情況及與微血管密度的關(guān)系研究尚少，因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化S-P法、westernblot法和ELISA方法檢測(cè)人乳腺癌中TWEAK及其受體Fn14的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討TWEAK及Fn14與微血管密度MVD的關(guān)系。 材料與方法:1.材料35例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和35例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院2003年到2004年間手術(shù)切除的乳腺癌組織，患者術(shù)前均未接受

4、過(guò)放化療，同時(shí)取30例正常乳腺組織作對(duì)照，組織經(jīng)4％多聚甲醛固定，石蠟包埋。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(低轉(zhuǎn)移)、MDA-MB-231(高轉(zhuǎn)移)購(gòu)與中科院上海細(xì)胞培養(yǎng)中心，其中MCF-7以DMEM培養(yǎng)液，MDA-MB-231以RPMI1640培養(yǎng)液，5％CO2，37℃培養(yǎng)。 2.主要試劑和來(lái)源兔抗人多克隆anti-Tweak抗體(sc-5558)、羊抗人多克隆anti-Fn14抗體(sc-27141)均購(gòu)自SantaCruz公司，鼠

5、抗人單克隆anti-CD34抗體(sc-M716529)購(gòu)自Daco公司，S-P超敏免疫組織化學(xué)試劑盒(KIT-9706、KIT-9709)和DAB酶底物顯色試劑盒(DAB-0031)均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。ELISA試劑盒購(gòu)于Bender公司。 3.方法3.1免疫組化：對(duì)35例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、35例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及正常乳腺組織進(jìn)行抗Tweak多克隆抗體、抗Fn14多克隆抗體和抗CD34單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色。簡(jiǎn)單

6、的說(shuō)，切片經(jīng)脫蠟，經(jīng)高壓修復(fù)預(yù)處理，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉，一抗孵育，經(jīng)DAB染色，蘇木素對(duì)比染色。染色方法按鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(S-P)法試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。 3.2ELISA實(shí)驗(yàn)收取兩株細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心3000/分、4℃，離心10分鐘，獲得上清夜以備用。操作按ELISAInstant試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。 3.3免疫印跡WesternBlot：收集細(xì)胞，加入裂解液，經(jīng)超聲粉碎后高速低溫離心，1

7、3000轉(zhuǎn)/分，4℃、0.5小時(shí)，取上清為細(xì)胞總蛋白。電泳(15％SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印，5％正常小牛血清封閉液封閉，抗TWEAK(1∶200)和抗β-actin(1∶400)4℃孵育過(guò)夜；與二抗(1∶50)在室溫下孵育1小時(shí)，DAB顯色3-10分鐘，雙蒸水沖洗，干燥，避光保存。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：采用SPSSforwindows13.0軟件，對(duì)Tweak及Fn14的表達(dá)與MVD的關(guān)系進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，對(duì)TWEAK與Fn1

8、4的相關(guān)性進(jìn)行Spearson分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1.乳腺癌中TWEAK的表達(dá)：(1)免疫組化結(jié)果顯示：TWEAK在乳腺癌中表達(dá)明顯高于在乳腺正常組織中的表達(dá)(P＜0.05)，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)明顯高于在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)(P＜0.05)。 (2)WesternBlot結(jié)果顯示在高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系TWEAK的表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系(P＜0.05)。 (3)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

9、顯示在高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系中可溶性TWEAK的分泌高于低轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞系(P＜0.05)。 2.乳腺癌中Fn14的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示：Fn14在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常乳腺組織中的表達(dá)(P＜0.05)，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)高于在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)(P＜0.05)。 3.TWEAK、Fn14的表達(dá)與MVD的關(guān)系(1)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中TWEAK的表達(dá)與MVD明顯相關(guān)(P＜0.05)。乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中TWEAK的

10、表達(dá)與MVD的差異不顯著(P＞0.05)。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中MVD明顯高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌(P＜0.05)。 (2)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Fn14表達(dá)與MVD的差異不顯著(P＞0.05)，乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中Fn14表達(dá)與MVD無(wú)明顯差別(P＞0.05)。 4.TWEAK與Fn14的相關(guān)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中TWEAK與Fn14的表達(dá)密切相關(guān)(P＜0.05)，乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中TWEAK與Fn14的表達(dá)未見(jiàn)明顯的相關(guān)(P＞0.05)。