一種新的人NK細胞系的特性及其抗腫瘤效應研究.pdf

1、自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK細胞)作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員在機體抗腫瘤免疫中扮演重要的角色。使用NK細胞進行抗腫瘤治療已引起人們高度的重視，目前已有研究進入了臨床實驗階段。基于NK細胞的腫瘤免疫治療包括內(nèi)源性NK細胞的誘導活化、同種反應性NK細胞輸注、體外擴增的自體或供者NK細胞及NK細胞系的過繼轉輸?shù)取Ｏ啾容^而言，自體或同種異體NK細胞在進行抗瘤治療時存在一定的局限性，而永生化的人NK細胞系因具有較強的

2、細胞毒作用、體外易擴增培養(yǎng)、且不存在其他細胞污染等優(yōu)點，可以克服自體或異體NK細胞的局限性，具有很好的臨床應用前景。現(xiàn)有可用于腫瘤治療的NK細胞系(NK-92細胞)由西方國家建立，盡管HLA分子不匹配是NK細胞行駛功能的有益因素，但是由于不同種族間HLA分子的差異很可能在受者體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA的抗體從而抑制免疫治療的效果，故西方國家建立的NK細胞系可能不適合用于中國腫瘤病人的治療。因此，建立國人的NK細胞系并將其用于腫瘤治療尤為重要。

3、r>　　 另外，腫瘤的診斷及分期對于臨床治療方案的制定至關重要。肺癌作為惡性腫瘤中最常見的死亡原因，嚴重威脅人類的健康。肺癌的高轉移率和復發(fā)率嚴重阻礙肺癌患者生存期的提高，尋找用于循環(huán)腫瘤細胞監(jiān)測的標志物并建立合適的檢測方法成為亟需解決的問題。
　　 本研究利用流式細胞術對本室己建立的人NK細胞系(NKG細胞)的表型、活化狀態(tài)及功能分子的表達進行分析；利用3H摻入實驗測定不同劑量輻照后NKG細胞的增殖情況；利用51Cr殺傷實驗

4、測定NKG細胞的細胞毒活性；建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型評價NKG細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性；利用波浪式生物反應器建立NKG細胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程，建立NKG細胞主細胞庫和工作細胞庫，并按《藥典》三部(2005年版)的相關要求進行了細胞鑒別試驗、無菌試驗、外源性因子檢測、致瘤性檢查及急性毒性試驗。另外，應用實時熒光定量PCR的方法檢測LunX等多利腫瘤標志物mRNA的水平，分析LunX mRNA與肺癌病理分期及臨床治療效果之間的關系。利用上述

5、方法所取得的研究結果如下：
　　 1. NKG細胞表型及功能分子的表達
　　 NKG細胞是本研究室863課題組于2003年建立的永生化的人NK細胞株。NKG細胞懸浮生長，成團細胞較多，倍增時間為2-3天。NKG細胞的表型鑒定為CD56+CD16-CD27-CD3-αβTCR-γδTCR-CD4-CD8-CD19-CD161-CD45+。NKG細胞表面表達高水平CD2、CD58、CD11a、CD54、CD11b及CD11c

6、等粘附分子；高表達共刺激分子CD48。NKG細胞表面表達抑制性受體CD94/NKG2A、CD158b和CD85j，同時亦表達高水平NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和NKG2C等活化性受體。另外，與細胞殺傷功能相關的TRAIL、FasL、granzyme B、perforin和IFN-γ等均在NKG細胞中表達。上述結果表明，NKG細胞具有活化性NK細胞的特征。
　　 2.NKG細胞的抗腫瘤細胞毒活性及其分子機制

7、>　　 NKG細胞對多種腫瘤細胞系均有較強的殺傷活性，尤其是對SGC7901和Ho-8910細胞的殺傷活性＞80％(E/T=20/1)。NKG細胞對Ho-8910細胞的殺傷活性明顯高于NK-92、NKL及YT細胞。體外抗體阻斷及中和實驗表明NKG細胞的細胞毒活性主要依賴于NKG2D和NKp30識別機制。當γ輻照劑量達800cGy時，輻照后的NKG細胞失去增殖能力，但在48小時內(nèi)維持其對腫瘤細胞的殺傷活性。體外實驗進一步證明800cGy

8、輻照后的NKG細胞對原代分離的人卵巢癌細胞具有較強的殺傷活性(75％～45％，E/T=20/1)。
　　 3.人卵巢癌小鼠模型中NKG細胞的免疫治療作用
　　 利用Ho-8910細胞以腹腔注射的方式接種裸鼠，成功建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型。當將800cGy輻照后的NKG細胞與Ho-8910細胞按5∶1混合后接種裸鼠，結果顯示小鼠成瘤時間由28～44天延遲至90～135天，成瘤率由100％明顯降低至50％。NKG細胞治療組

9、小鼠腹圍明顯減少，盡管在觀察時間內(nèi)50％小鼠死亡，但其平均生存時間由61.5天明顯延長至210.2天。以上結果表明NKG細胞在小鼠體內(nèi)對人卵巢癌細胞具有明顯的殺傷功能。
　　 當在Ho-8910細胞接種后第21天，給予800cGy輻照后的NKG細胞進行治療，結果表明治療組小鼠成瘤時間由28～38天延后至56～66天，小鼠成瘤率由100％降低至62.5％，成瘤鼠病情進展較緩慢，平均生存時間由64.6天延長至119.6天。當在Ho-

10、8910細胞接種后第35天選擇已成瘤小鼠，給予800cGy輻照后的NKG細胞進行治療，結果表明治療后小鼠腹圍變化較對照組明顯減慢，盡管最終治療組小鼠亦全部死亡，但其平均生存時間由64.2天明顯延長至93.6天。上述動物模型的結果表明，輻照后NKG細胞具有明顯的治療卵巢癌的作用。
　　 4.NKG細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝的建立
　　 利用波浪式生物反應器建立NKG細胞大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)的工藝流程，具體流程如下：接種密度：2.0×10

11、4cells/ml；培養(yǎng)基：α-MEM完全培養(yǎng)基(α-MEM液體培養(yǎng)基含10％新生牛血清、10％馬血清)，添加終濃度為100U/ml的rhIL-2；接種體積：500ml，分別于接種后2、4、6天補加500ml完全培養(yǎng)基及rhIL-2溶液(終濃度為100U/ml)；最大培養(yǎng)體積：＜2000ml。培養(yǎng)條件：37℃，5.0％CO2，CO2流速為0.15L/min，7rpm/7°。按照該工藝流程培養(yǎng)得到的NKG細胞數(shù)量、純度及殺傷活性等均可滿足

12、臨床治療的要求。
　　 5.NKG細胞急性毒性檢測
　　 使用高于臨床使用劑量150倍的NKG細胞(1×108cells/鼠)，經(jīng)800cGy輻照后通過腹腔注射的方式輸入C57BL/6小鼠體內(nèi)，連續(xù)觀察7天，三批小鼠均為未發(fā)生毒性反應、過敏反應、局部刺激反應；實驗組及對照組小鼠體重增加平穩(wěn)，小鼠體重及體重增加量兩組之間均無顯著性差異，說明NKG細胞無急性毒性作用。
　　 6.NKG細胞種子庫的建立及檢定
　

13、　 利用本研究建立的NKG細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝，建立主細胞庫及工作細胞庫。對工作細胞庫的檢定結果表明，NKG細胞的表型與原始庫一致，無細菌、真菌及支原體污染，外源性病毒因子檢測為陰性，體內(nèi)外均無致瘤性。
　　 7.LunX mRNA在非小細胞肺癌轉移早期診斷及療效評價中的作用
　　 利用實時熒光定量RT-PCR方法檢測肺癌患者、健康人、肺炎患者及其他腫瘤患者(包括乳腺癌和食道癌)的外周血或胸水樣品中LunX、CEA、CK

14、19、VEGF-c、hRNPA2/B1等腫瘤標志物mRNA的水平，結果表明LunX mRNA僅在非小細胞肺癌患者的外周血(75.0％，33/44)及胸水(92.9％，13/14)中有表達，而在健康人、肺炎、其他上皮來源的腫瘤患者外周血及結核性胸膜炎胸水中均無表達，明顯優(yōu)于其他各種標志物，而且外周血中LunX mRNA的水平及其陽性率與肺癌的臨床分期成正相關。進一步對非小細胞肺癌患者治療前后外周血中上述基因mRNA的表達情況進行檢測分析，

15、結果表明治療后患者外周血中LunX、CK19mRNA水平較治療前明顯降低，治療前后VEGF-C、CEA、hnRNP A2/B1 mRNA表達水平無明顯差異。LunX與CK19 mRNA均可作為療效評價的指標，但因CK19mRNA在其他腫瘤患者外周血中亦有表達，故LunX mRNA作為肺癌患者治療效果評價的指標更為靈敏和特異。
　　 結論：
　　 NKG細胞具有活化的人NK細胞特征，對多種腫瘤細胞具有很強的細胞毒作用。利用