功能獲得性篩選的miR-137抑制胃癌增殖的機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　MiRNAs(microRNAs)，是近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域主要的研究熱點(diǎn)之一。功能研究提示miRNAs幾乎參與了所有人類已知的細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控，包括腫瘤在內(nèi)的人體許多病理進(jìn)程中都檢測到了miRNAs表達(dá)的變化。在后生動(dòng)物和植物中，miRNAs是轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子。越來越多的研究表明，miRNAs在人類癌癥起始和進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，功能上充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色。
　　胃癌是人類第二大最

2、主要癌癥相關(guān)性死亡病因，日本，韓國和中國所在的亞洲東北部則是世界上胃癌發(fā)病率最高的地域。胃癌給國人的健康造成了巨大威脅。而胃癌確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，缺乏特異性的治療靶點(diǎn)。因此，從不同的角度、不同的分子水平探索胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，或許能找到治療胃癌的突破口。miRNAs的發(fā)現(xiàn)無疑給人類戰(zhàn)勝胃癌帶來了新的希望，其在胃癌中的作用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未被闡明。本研究即從增殖這個(gè)胃癌最基本的惡性表型入手，探討miRNAs在胃癌增殖中發(fā)揮的調(diào)控作用。
　

3、　【目的】
　　基于高通量功能獲得性篩選尋找抑制胃癌細(xì)胞增殖的miRNAs分子群；對(duì)其中關(guān)鍵miRNAs分子抑制胃癌增殖的作用進(jìn)行驗(yàn)證；探討關(guān)鍵miRNAs分子抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制；并進(jìn)一步探討關(guān)鍵miRNAs分子在胃癌組織中的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性；從而從轉(zhuǎn)錄后水平揭示胃癌增殖的新機(jī)制，為胃癌治療提供新的靶點(diǎn)，也為關(guān)鍵miRNAs分子將來有可能應(yīng)用于臨床奠定初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　

4、1．利用miR-Ribo?miRNAmimicsLibrary(Human)v14.0文庫（庫容量：904個(gè)人類miRNAsmimics），借助RT-CES系統(tǒng)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901基于增殖表型進(jìn)行高通量功能獲得性篩選，獲得了12個(gè)抑制胃癌細(xì)胞增殖的miRNAs分子，其中miR-137抑制胃癌細(xì)胞增殖效果最為顯著。
　　2．RealtimeRT-PCR驗(yàn)證miR-137在人胃癌細(xì)胞系（SGC7901、AGS、MKN45）、永生化

5、正常人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1和11例原發(fā)性胃腺癌組織及配對(duì)正常胃粘膜組織中的表達(dá)。
　　3．上調(diào)miR-137在胃癌細(xì)胞系SGC7901、AGS中的表達(dá)，MTT、平板克隆及軟瓊脂克隆形成等體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-137對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。
　　4．構(gòu)建miR-137過表達(dá)慢病毒載體，并成功建立miR-137過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系LV-miR-137SGC7901,裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-137對(duì)體內(nèi)成瘤的影響。
　　5

6、．上調(diào)miR-137在SGC7901、AGS中的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-137對(duì)SGC7901、AGS細(xì)胞周期和凋亡的影響，EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測miR-137對(duì)SGC7901和AGSDNA復(fù)制能力的影響。
　　6．運(yùn)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測miR-137可能的下游靶基因，并對(duì)預(yù)測的靶基因進(jìn)行功能聚類分析，結(jié)合文獻(xiàn)、預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方法，初步判斷CDK6可能是miR-137的靶基因之一。
　　7．在3例原發(fā)性胃腺癌組織及配對(duì)正

7、常胃粘膜組織中，分別用realtimeRT-PCR和WesternBlot檢測miR-137和CDK6的表達(dá)，探討miR-137和CDK6表達(dá)的相關(guān)性。
　　8．轉(zhuǎn)染miR-137mimics上調(diào)SGC7901和AGS中miR-137的表達(dá)，realtimeRT-PCR、WesternBlot檢測CDK6在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的變化；轉(zhuǎn)染miR-137inhibitor下調(diào)GES-1中miR-137的表達(dá)，realtimeRT

8、-PCR、WesternBlot檢測CDK6在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的變化。構(gòu)建野生型CDK63′UTR的螢光素酶報(bào)告載體psiCHECK2-CDK6和突變體psiCHECK2-CDK6-mut，分別與miR-137mimics共轉(zhuǎn)染，檢測螢光素酶活性變化。
　　9．轉(zhuǎn)染siCDK6下調(diào)CDK6在SGC7901和AGS中的表達(dá)，MTT比色實(shí)驗(yàn)檢測SGC7901和AGS增殖的變化，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC7901和AGS細(xì)胞周期的

9、變化。
　　10．RealtimeRT-PCR檢測miR-137在38例石蠟包埋胃腺癌組織中的表達(dá)水平，并將miR-137在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　【結(jié)果】
　　1．高通量獲得性篩選得到12個(gè)顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖的miRNAs分子，其中miR-137可能是抑制胃癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子。
　　我們借助RT-CESTM系統(tǒng)對(duì)miR-Ribo?miRNAmimicsLibrary

10、(Human)v14.0文庫904條人類miRNAsmimics進(jìn)行了高通量功能獲得性篩選。Zscore＜-3的miRNAsmimics被認(rèn)為是顯著抑制SGC7901增殖的陽性分子?；谝陨虾Y選策略，我們得到了12個(gè)顯著抑制SGC7901增殖的miRNA分子，分別是miR-30b，miR-137，miR-363，miR-124*，miR-15a，miR-149，miR-15b*，miR-376b，miR-571，miR-622，miR-

11、339-3p和miR-1321。其中miR-137抑制胃癌細(xì)胞SGC7901增殖效果最為顯著(ZScore=-3.84，Relativegrowthrate=0.51)，提示miR-137可能是抑制胃癌增殖表型的關(guān)鍵miRNA分子。
　　2．miR-137在胃癌細(xì)胞系和原發(fā)性胃腺癌組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)。
　　我們用realtimeRT-PCR方法分別在胃癌細(xì)胞系及原發(fā)性胃腺癌組織中檢測了miR-137的表達(dá)水平。結(jié)果提示，

12、相對(duì)于正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1，miR-137在胃癌細(xì)胞系表達(dá)水平顯著降低；相對(duì)于正常胃粘膜上皮，miR-137在原發(fā)性胃腺癌組織中表達(dá)水平亦顯著降低。
　　3．上調(diào)miR-137的表達(dá)能顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1／S阻滯。
　　分別在SGC7901及AGS中上調(diào)miR-137的表達(dá)，MTT比色實(shí)驗(yàn)、平板克隆及軟瓊脂克隆形成等體外功能實(shí)驗(yàn)檢測了miR-137對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的對(duì)照

13、組相比，上調(diào)miR-137表達(dá)能顯著抑制SGC7901及AGS細(xì)胞增殖。我們構(gòu)建了miR-137過表達(dá)慢病毒載體，并成功建立了miR-137過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系LV-miR-137SGC7901。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示上調(diào)miR-137的表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的能力。流式細(xì)胞周期檢測提示上調(diào)miR-137的表達(dá)能夠?qū)е耂GC7901和AGS出現(xiàn)G1/S期阻滯，對(duì)凋亡無明顯影響。EdU細(xì)胞增殖檢測提示上調(diào)miR-137的表達(dá)能夠顯著

14、抑制SGC7901和AGS細(xì)胞的DNA復(fù)制。
　　4．生物信息學(xué)預(yù)測提示CDK6可能是miR-137的靶基因。
　　我們借助了多種預(yù)測軟件對(duì)miR-137的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示TargetScan、PicTar、miRanda和RNAhybrid4種預(yù)測軟件均能預(yù)測到CDK6為miR-137的靶基因。CDK63′UTR與miR-137“種子區(qū)”序列匹配，且CDK6是促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)鍵分子，我們初步選定CDK6作為m

15、iR-137下游關(guān)鍵分子進(jìn)行研究。
　　5．miR-137和CDK6在胃癌組織及正常胃粘膜組織中的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　我們?cè)?例原發(fā)性胃腺癌組織及配對(duì)正常胃粘膜組織中，分別用realtimeRT-PCR和WesternBlot檢測了miR-137和CDK6的表達(dá)水平，結(jié)果提示miR-137與CDK6在胃癌組織及正常胃粘膜組織中的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　6．miR-137負(fù)性調(diào)控CDK6的表達(dá)。
　　我

16、們?cè)趍iR-137低表達(dá)的SGC7901和AGS細(xì)胞系上調(diào)miR-137的表達(dá)，結(jié)果提示，和對(duì)照組相比，上調(diào)miR-137表達(dá)后CDK6在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)水平均顯著下調(diào)。我們又在miR-137高表達(dá)的GES-1細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-137inhibitor下調(diào)miR-137的表達(dá)，結(jié)果提示，和對(duì)照組相比，下調(diào)miR-137表達(dá)后CDK6在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均顯著升高。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示miR-137能夠顯著抑制野生

17、型psiCHECK2-CDK6及突變體psiCHECK2-CDK6-mut1（7133-7139位堿基）或psiCHECK2-CDK6-mut2（7114-7120位堿基）的螢光素酶活性，而對(duì)對(duì)照組lucCtrl和突變體psiCHECK2-CDK6-mut3(mut1+mut2)的螢光素酶活性無影響,從而進(jìn)一步確證了CDK6為miR-137的靶基因；通過與CDK63′UTR7114-7120和/或7133-7139位堿基相互作用，miR

18、-137負(fù)性調(diào)控CDK6的表達(dá)。
　　7．miR-137通過負(fù)性調(diào)控CDK6抑制胃癌增殖。
　　用siCDK6下調(diào)CDK6在SGC7901和AGS中的表達(dá)，MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SGC7901和AGS增殖能力顯著減弱，進(jìn)一步流式細(xì)胞周期檢測提示SGC7901和AGS出現(xiàn)了G1/S期阻滯。綜上，下調(diào)CDK6的表達(dá)引起的胃癌細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞周期G1/S期阻滯效應(yīng)與上調(diào)miR-137在胃癌細(xì)胞的表達(dá)引起的效應(yīng)類似，且效果相當(dāng)。所

19、以，miR-137抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，至少部分可以歸結(jié)為miR-137通過對(duì)其下游靶基因CDK6的負(fù)性調(diào)控，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞出現(xiàn)G1/S期阻滯所致。
　　8．miR-137在原發(fā)性胃腺癌組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后顯著相關(guān)。
　　我們將miR-137在38例石蠟包埋胃腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征及術(shù)后生存時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：miR-137的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)

20、（p＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)。miR-137高表達(dá)組(n=19)患者術(shù)后生存時(shí)間顯著優(yōu)于低表達(dá)組(n=19)（LogRank=6.981，P=0.008）。
　　【結(jié)論】
　　基于胃癌增殖表型的高通量功能獲得性篩選，我們首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抑制胃癌增殖的miRNAs分子群，而miR-137可能是這個(gè)群體中調(diào)控胃癌增殖的關(guān)鍵miRNA分子；miR-137通過負(fù)性調(diào)控CDK6的表達(dá)引起細(xì)胞周期G1／S期阻滯，從