普羅布考、西洛他唑?qū)Υ笫蠊撬柙葱詢?nèi)皮祖細(xì)胞PI3K-Akt信號通路影響的體外研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類具有游走特性的能定向增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。1997年，Asahara首次從人外周血單核細(xì)胞分離出CD34+和血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)均為陽性的單核細(xì)胞，其在體外培養(yǎng)呈梭形，可形成管腔樣結(jié)構(gòu)，能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抗原，故命名為EPCs。EPCs主要位于骨髓之中，在機(jī)體出現(xiàn)缺血、組織損傷或受到細(xì)胞因子、藥物等刺激的情況下

2、，可從骨髓向靶部位動員、歸巢、分化，形成新生血管，參與血管再生及損傷血管的再內(nèi)皮化。
　　 PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生長、代謝、分化的重要信號通路。Akt是PI3K下游最主要的作用靶標(biāo)，PI3K激活導(dǎo)致Akt活化。Akt在PDK-1的作用下完成Ser473和Thr308磷酸化。這樣完全活化的Akt從細(xì)胞膜上釋放下來繼續(xù)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，參與多種細(xì)胞活動、物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)。有研究顯示，PI3K基

3、因敲除鼠的Akt磷酸化降低，單側(cè)肢體缺血后的新生血管形成減少，EPCs整合入內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)及遷移的能力減低。
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，嚴(yán)重危害人類健康。內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是動脈硬化性疾病的標(biāo)志，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)或再生可以通過周圍成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移來完成。但成熟的內(nèi)皮細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，其修復(fù)和替代受損內(nèi)皮細(xì)胞的能力相對有限

4、。因此，EPCs作為一種具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞，在血管修復(fù)中起著重要作用。
　　 普羅布考(Probucol)和西洛他唑(Cilotazol)作為目前較好的抗AS藥物，其新的作用機(jī)制及應(yīng)用正在被進(jìn)一步認(rèn)識。普羅布考于1977年首先在美國上市，最初以降脂藥應(yīng)用于臨床。近幾年隨著研究的不斷進(jìn)展發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、預(yù)防或延緩AS的發(fā)生和發(fā)展、改善內(nèi)皮功能，同時(shí)還具有防治心血管疾病、保護(hù)肝臟等多種作用。西洛他唑是一種選擇性

5、磷酸二酯酶Ⅲ(PDEⅢ)抑制劑，可抑制血小板及平滑肌內(nèi)磷酸二酯酶的水解，使cAMP在血小板和血管內(nèi)的含量上升，抑制了血小板聚集和擴(kuò)張血管作用，防止血栓形成和血管閉塞，臨床現(xiàn)廣泛用于慢性動脈閉塞癥的治療，在抗動脈粥樣硬化防治血管形成術(shù)后再狹窄等方面引起人們的廣泛關(guān)注。隨著進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，西洛他唑還具有其他安全有效的心血管治療作用。
　　 本研究的主要目的是探討普羅布考和西洛他唑?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞PI3K/Akt信號通路的影響。

6、闡明普羅布考和西洛他唑影響下的內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生作用的潛在機(jī)制，從而為AS等缺血性疾病的治療和新藥的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 一、大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 采用密度梯度離心法從Wistar大鼠骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于含有10％胎牛血清的EBM-2MV培養(yǎng)基中，制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行培養(yǎng);收集培養(yǎng)5d的EPCs，免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD133、vWF相關(guān)抗原檢

7、測，鑒定其為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 二、Real time RT-PCR檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞中PI3K和Akt mRNA的表達(dá)
　　 采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測不同濃度普羅布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)作用后的EPCs中PI3K、Akt mRNA的表達(dá)情況。
　　 三、Western Blot檢測內(nèi)

8、皮祖細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白的表達(dá)
　　 采用Western Blot檢測不同濃度普羅布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)作用后的EPCs中PI3K/Akt信號通路中PI3K、Akt相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

9、析和處理，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、EPCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 原代培養(yǎng)24h后，細(xì)胞大部分呈小圓形;差速貼壁篩選后，培養(yǎng)1d可見少量細(xì)胞貼壁;4d后細(xì)胞開始伸展成梭形或紡錘形;7d有細(xì)胞集落形成，生長旺盛;大約14d融合成內(nèi)皮細(xì)胞單層典型的鋪路石樣形態(tài)。培養(yǎng)第5天CD133、vWF雙陽性熒光染色為正在分化的EPCs。
　　 二、普羅布考、西洛

10、他唑?qū)PCs中PI3K/Akt信號通路的影響
　　 1、在培養(yǎng)7天的EPCs中加入不同濃度普羅布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)，作用24小時(shí)后，采用Real time RT-PCR方法檢測EPCs中PI3K和Akt的表達(dá)情況。結(jié)果表明，普羅布考和西洛他唑可以促進(jìn)EPCs中PI3K和Akt的mRNA的表

11、達(dá)。藥物作用組與不加藥物的對照組比較，P＜0.05。
　　 2、在培養(yǎng)7天的EPCs中加入不同濃度普羅布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)，作用24小時(shí)后，采用Western Blot檢測PI3K和Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，普羅布考和西洛他唑可以促進(jìn)EPCs中PI3K和Akt蛋白的表達(dá)。對灰度值的相對