一個新的負(fù)性調(diào)節(jié)元件對乙型肝炎病毒啟動子調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染后導(dǎo)致的急、慢性乙型肝炎危害巨大，迄今沒有有效的治療方法。HBV依靠自身嚴(yán)密的調(diào)控機制，保證病毒持續(xù)復(fù)制增殖，從而在體內(nèi)建立持久感染。HBV表達(dá)調(diào)控是近年來分子生物學(xué)研究的重點之一，各種肝細(xì)胞核因子和調(diào)節(jié)元件通過作用于HBV啟動子而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。我們在前期研究HBV正鏈轉(zhuǎn)錄體的工作中運用PCR的方法對HBV全基因組進(jìn)行掃描，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄PCR及實時定量PCR等檢測方法，發(fā)現(xiàn)HBV基因中

2、的nt453-250為一個新的負(fù)性調(diào)節(jié)元件(NRE)；通過構(gòu)建該元件的方向及位點突變體，證實了該元件的作用方式無方向及位點依賴性。本課題在前期實驗基礎(chǔ)上研究該元件對HBV啟動子的調(diào)節(jié)作用，相關(guān)研究對于深入了解HBV致病機理及尋找有效的抗病毒治療方法具有重要意義。 本課題通過構(gòu)建四對分別含HBV啟動子片段CP、SP1、SP2和XP的重組質(zhì)粒，每對質(zhì)粒中一個為實驗組(即在質(zhì)粒pGL3control的luciferace基因下游插入序

3、列nt250-453)，一個為對照組(即未插入序列nt250-453)，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)及RT-PCR方法檢測該負(fù)性調(diào)節(jié)元件是否對HBV的四種啟動子存在下調(diào)作用，選擇下調(diào)作用最顯著的啟動子作為下一部分研究對象。研究結(jié)果表明，四個實驗組中的蟲熒光素酶活性均低于相應(yīng)對照組，且蟲熒光索酶基因表達(dá)在mRNA水平同樣被卜調(diào)，其中對XP的下調(diào)作用尤為明顯。在此基礎(chǔ)上，通過定點缺失突變的方法在含有HBV(ayw)全基因組，能表達(dá)病毒前基因組RN

4、A，但不能表達(dá)病毒核心蛋白和P蛋白的質(zhì)粒LJ196上將nt250-453序列缺失，再將突變質(zhì)粒與HBV C蛋白和P蛋白的表達(dá)質(zhì)粒LJ96共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)染模型，以保證轉(zhuǎn)染后HBV能在HepG2細(xì)胞中復(fù)制，在病毒的生活周期中明確其對XP的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。利用RT-PCR檢測缺失nt250-453序列的病毒X mRNA表達(dá)量，Western blot檢測HBV X蛋白表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)，缺失了nt250-453基因序列的HBV的

5、X mRNA及X蛋白表達(dá)量均高于未突變組，從而在HBV上間接驗證了HBVnt250-453對XP的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。 本課題的研究結(jié)果證實了nt250-453作為HBV上一個新的負(fù)性調(diào)節(jié)元件對HBV四個啟動子的啟動作用均有不同程度下調(diào)，其中對XP作用最強。并且通過在HBV上構(gòu)建缺失該序列的瞬時轉(zhuǎn)染模型也證實了它在病毒的生活周期中同樣具有對XP的下調(diào)作用。而XP轉(zhuǎn)錄的0.8kb mRNA的編碼產(chǎn)物X蛋白是一種反式激活因子，可以激活多種