apoA-Ⅰ對乙型肝炎病毒啟動(dòng)子的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：篩選乙型肝炎病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并對其中之一的apoA-I因子與乙肝病毒各啟動(dòng)子的相互作用進(jìn)行深入研究。
　　 方法：首先采用等離子共振技術(shù)對乙型肝炎病毒啟動(dòng)子結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選：將結(jié)合有親和素的HBV各啟動(dòng)子耦聯(lián)在SA芯片上，使核酸序列游離于芯片之上，與流動(dòng)相的HepG2.2.15細(xì)胞核蛋白充分接觸，洗脫并回收與啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白。該結(jié)合蛋白混合品經(jīng)short-gun質(zhì)譜分析，顯示在乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子、S1、S2啟動(dòng)

2、子的結(jié)合蛋白中，均有載脂蛋白A-I(apoA-I).隨后構(gòu)建含有apoA-I基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-apoA-I及含有HBVS1、S2、x啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pCAT3-S1、pCAT3-S2、pcAT3-x。用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以pcDNA3.1及pcAT3-basic為對照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞蛋白，用檢測CAT的ELIsA試劑盒檢測各組蛋白中報(bào)告基因CAT含量。然后再采用等離子共振技術(shù)對apoA-I與各啟動(dòng)子的

3、結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證及動(dòng)力學(xué)分析：將apoA-I蛋白耦聯(lián)在CM5芯片上作為固定相，以各啟動(dòng)子核酸片段為流動(dòng)相，獲得該蛋白與各啟動(dòng)子核酸的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并利用激光共聚焦顯微鏡和western blotting對該蛋白在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位及表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　 結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示，乙肝病毒復(fù)制細(xì)胞模型HepG2.2.15細(xì)胞中apoA-I mRNA表達(dá)顯著高于無乙肝病毒復(fù)制