病原性絲狀真菌快速診斷和鑒定的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分絲狀真菌DNA提取方法的比較和優(yōu)化
　　 目的篩選適合提取絲狀真菌模板DNA的方法。方法比較2個菌落培養(yǎng)時間段（3d內(nèi)和7～14d）提取DNA質(zhì)量的差異：運(yùn)用氯化芐法、CTAB法、Biospin法和微波法分別提取黑曲霉基因組DNA，后用直接電泳、濃度測定、PCR擴(kuò)增等方法比較所提DNA的濃度和質(zhì)量；選出最優(yōu)方法，用8種常見絲狀真菌進(jìn)行檢驗(yàn)和驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)3天內(nèi)的菌落提取的DNA純度較高，無需純化即可用于

2、后續(xù)實(shí)驗(yàn)；4種方法制備的DNA均可用于PCR等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中以CTAB法提取的DNA純度好，產(chǎn)率最高。結(jié)論CTAB法是一種適用于絲狀真菌DNA提取的簡便方法。
　　 第二部分 PCR-RFLP技術(shù)快速鑒別8種致病絲狀真菌病原菌的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的建立能應(yīng)用于臨床檢測深部絲狀真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法用真菌通用引物擴(kuò)增煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉、尖端賽多孢和串珠鐮刀菌的ITS區(qū)，分

3、別用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ，TaqⅠ和MspⅠ5種限制性核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，建立以PCR為基礎(chǔ)的RFLP方法，然后對22株臨床株和2株環(huán)境分離株進(jìn)行PCR-RFLP圖譜分析。結(jié)果對PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析可以準(zhǔn)確鑒定8種深部致病絲狀真菌，從DNA提取到酶切分析可以在一個工作日中完成；22株臨床株和2株環(huán)境分離株P(guān)CR-RFLP鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。結(jié)論P(yáng)CR-RFLP技術(shù)是一種能夠快速鑒定深部感染絲狀

4、真菌的有效方法。
　　 第三部分多重PCR檢測深部曲霉感染病原菌的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的建立能同時鑒別多種曲霉病原菌的多重PCR體系。方法篩選4種最常見深部曲霉感染病原菌（煙曲霉、黃曲霉、土曲霉和黑曲霉）的特異性引物建立多重PCR體系，用該體系檢測4種曲霉單模板、雙模板和三模板的擴(kuò)增情況，用DNA模板連續(xù)稀釋的方式檢測該反應(yīng)體系的敏感性。然后對22株臨床株和2株環(huán)境分離株進(jìn)行檢測。結(jié)果該多重PCR體系有較好的特異性，4種曲

5、霉分別擴(kuò)增出250 bp，200bp，450 bp和150 bp的DNA片段，電泳圖中能夠很好區(qū)別；在合適的反應(yīng)條件下，對單模板、雙模板和三模板均能擴(kuò)增出目的片段，未見明顯非特異片段的干擾；多重PCR體系的敏感性為100pg，較單種特異性引物的敏感性（10pg）略差。結(jié)論多重PCR體系能夠檢測4種曲霉的單純感染和混合感染，是一種快速、敏感、特異性強(qiáng)的診斷方法。
　　 第四部分菌落PCR快速鑒別絲狀真菌的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目

6、的探討菌落PCR在檢測絲狀真菌病原菌方面的運(yùn)用。方法初步建立絲狀真菌菌落PCR的檢測技術(shù)，用19種絲狀真菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行驗(yàn)證，選取部分菌種的菌落PCR產(chǎn)物和酶切結(jié)果與常規(guī)PCR產(chǎn)物和酶切結(jié)果進(jìn)行比較；所有菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測其準(zhǔn)確性。結(jié)果19株菌中有16株（占84.2％）菌落PCR擴(kuò)增成功；其中有7株菌進(jìn)行了菌落PCR與常規(guī)PCR產(chǎn)物及酶切圖譜的比較，結(jié)果條帶完全一致；16株擴(kuò)增成功的菌株ITS區(qū)測序結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。結(jié)論菌

7、落PCR可以用于絲狀真菌的快速檢測，不僅縮短了菌落形態(tài)學(xué)鑒定所需的較長時間，而且也節(jié)省了制備模板DNA的時間和成本，是一種快速、經(jīng)濟(jì)的PCR檢測技術(shù)。
　　 第五部分菌落PCR快速鑒定菌種的臨床應(yīng)用
　　 目的探討菌落PCR在臨床標(biāo)本檢測中的應(yīng)用。方法收集1例皮下真菌感染的臨床標(biāo)本，在真菌培養(yǎng)長出菌落伊始即進(jìn)行菌落PCR檢測，擴(kuò)增ITS區(qū)進(jìn)行測序，鑒定病原菌的菌種；收集淺部真菌感染的臨床標(biāo)本（指趾甲、皮屑）11例，選擇真