植物病原真菌與昆蟲(chóng)病原真菌侵染寄主表皮的分子機(jī)制研究.pdf

1、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是水稻最重要的傳染性真菌病害，作為病原真菌致病機(jī)理研究的模式物種，其分子致病機(jī)制已被深入研究，而金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是研究昆蟲(chóng)病原真菌致病機(jī)理的模式真菌，廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)的生物防治。稻瘟病菌與綠僵菌分別侵染寄主表皮的過(guò)程十分相似，深入研究這兩種致病真菌，比較它們致病機(jī)制的異同，有助于闡明真菌侵染動(dòng)植物的分子機(jī)制，可為植物真菌病害防治、殺蟲(chóng)真菌農(nóng)藥研制提

2、供新的理論依據(jù)，對(duì)于植物病蟲(chóng)防治有著十分重要的意義。
　　侵染寄主植物表皮過(guò)程中，稻瘟病菌依靠細(xì)胞自噬，降解并回收分生孢子內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞器等，從而為附著胞的發(fā)育成熟及膨脹壓的累積提供物質(zhì)保證。因此，揭示稻瘟病菌的細(xì)胞自噬相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于認(rèn)識(shí)稻瘟病菌附著胞發(fā)育相關(guān)的分子機(jī)理、以及開(kāi)發(fā)新的稻瘟病防治靶標(biāo)具有重要意義。研究金龜子綠僵菌在寄主體表萌發(fā)、分化時(shí)期的基因表達(dá)情況，并與稻瘟病菌等植物病原真菌進(jìn)行比較分析，能夠?yàn)橥诰蛳x(chóng)生

3、真菌基因資源、鑒定金龜子綠僵菌的重要毒力性狀基因、揭示其致病的分子機(jī)理提供豐富信息。
　　本文通過(guò)分析稻瘟病菌MoVAC8、MoTSC13、MoTOR2和MoATG1基因的功能，對(duì)稻瘟病菌侵染寄主植物表皮時(shí)細(xì)胞核降解的分子機(jī)理和自噬調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。同時(shí)對(duì)綠僵菌侵染寄主蝗蟲(chóng)體表時(shí)的基因表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，比較了綠僵菌與稻瘟病菌之間致病機(jī)制的異同。
　　①有關(guān)稻瘟病菌的主要研究結(jié)果如下：
　　1）VAC8和TSC13是

4、酵母細(xì)胞核逐步微自吞（piecemeal microautophagy of nuclues，PMN）通路的關(guān)鍵基因，兩者在稻瘟病菌中的同源基因分別是MoVAC8和MoTSC13。酵母互補(bǔ)試驗(yàn)和酵母熒光蛋白yEGFP標(biāo)記試驗(yàn)表明VAC8基因在稻瘟病菌和酵母之間具有一定的功能保守性，而 TSC13的基因功能在酵母與稻瘟病菌之間高度保守。
　　2）GFP熒光蛋白標(biāo)記試驗(yàn)表明，稻瘟病菌的MoVAC8蛋白定位于細(xì)胞液泡膜表面，而MoTSC

5、13分布在細(xì)胞核外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面。GFP融合試驗(yàn)表明MoVAC8蛋白的SH4結(jié)構(gòu)域在MoVAC8蛋白中發(fā)揮膜定位信號(hào)肽的功能?；蚨c(diǎn)突變?cè)囼?yàn)表明，MoVAC8蛋白 SH4結(jié)構(gòu)域內(nèi)的肉豆蔻酰修飾位點(diǎn)甘氨酸（glycine）和3個(gè)棕櫚酰修飾位點(diǎn)半胱氨酸（cysteine）影響MoVAC8蛋白的正確膜定位以及蛋白參與咖啡因脅迫應(yīng)答的功能。
　　3）MoVAC8基因缺失突變體⊿Movac8對(duì)寄主水稻具有完全的致病能力，但對(duì)咖啡因高度敏

6、感。與野生型相比，MoTSC13基因缺失突變體⊿Motsc13突變體的營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力下降，對(duì)滲透壓脅迫和細(xì)胞壁干擾劑的敏感性增加，突變體附著胞分化出侵染釘?shù)谋壤@著降低，并且侵染菌絲增殖能力下降，從而導(dǎo)致致病力降低。
　　4）紅色熒光蛋白R(shí)FP標(biāo)記稻瘟病菌細(xì)胞核的熒光顯微觀察結(jié)果表明，細(xì)胞自噬突變體⊿Moatg1和⊿Moatg4在附著胞發(fā)育過(guò)程中，都不能順利降解分生孢子內(nèi)的細(xì)胞核，而突變體⊿Movac8和⊿Motsc13的

7、細(xì)胞核都可以正確降解。共表達(dá)MoVAC8:GFP和H1:RFP的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化菌株、以及共表達(dá) MoTSC13:GFP和H1:RFP的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化菌株中，酵母 PMN通路的典型亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)均不能被觀察到。以上結(jié)果表明，稻瘟病菌侵染相關(guān)的細(xì)胞核降解過(guò)程依賴(lài)于非選擇性自噬核心基因MoATG1和MoATG4，而與MoVAC8和MoTSC13的基因功能無(wú)關(guān)。
　　5）基因序列分析表明，MoTOR2編碼2469個(gè)氨基酸組成的蛋白，含有TOR蛋白

8、保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端的HEAT重復(fù)單元和FAT結(jié)構(gòu)域，以及C端的FRB結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域和FATC結(jié)構(gòu)域。GFP啟動(dòng)子融合試驗(yàn)和定量PCR試驗(yàn)表明，MoTOR2基因在侵染階段和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段組成型表達(dá)。
　　6）MoFKBP12基因的缺失突變體⊿Mofkbp12的表型分析和酵母雙雜交試驗(yàn)表明，雷帕霉素作為T(mén)OR蛋白的特異性激酶活性抑制劑，介導(dǎo) MoFKBP12蛋白與MoTOR2蛋白FRB結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。雷帕霉素能夠抑制稻瘟病

9、菌營(yíng)養(yǎng)菌絲的生長(zhǎng)、附著胞發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解、細(xì)胞有絲分裂、分生孢子內(nèi)的細(xì)胞自噬體的減少、附著胞內(nèi)細(xì)胞自噬體的增加，并能刺激分生孢子分化形成多個(gè)附著胞。
　　7）以MoTOR2基因內(nèi)FRB和FAT結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)為RNAi干擾靶標(biāo)，采用NaAc化學(xué)誘導(dǎo)基因沉默，成功下調(diào)了MoTOR2基因在營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)以及附著胞發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平。干擾轉(zhuǎn)化子的表型分析表明，MoTOR2調(diào)控分生孢子的細(xì)胞自噬和致病力。通過(guò)RNAi在附著胞中特異性

10、下調(diào)MoTOR2表達(dá)水平時(shí)，稻瘟病菌附著胞形成不受影響，但其對(duì)寄主的致病能力下降。MoTOR2及MoLST8基因在附著胞中同時(shí)特異超表達(dá)時(shí)，附著胞內(nèi)自噬體數(shù)量和稻瘟病菌的致病能力不受影響。
　　8）GFP熒光蛋白標(biāo)記試驗(yàn)表明，MoATG1蛋白廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)中，并在一些區(qū)域富集呈點(diǎn)狀，這些點(diǎn)狀區(qū)域的數(shù)量變化趨勢(shì)與自噬體的數(shù)量變化趨勢(shì)相一致，并且GPF:MoATG1融合蛋白的點(diǎn)狀富集區(qū)域能與mRFP標(biāo)記的自噬體部分共定位。MoATG

11、1基因定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)表明，MoATG1蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中與激酶活性相關(guān)的3個(gè)保守氨基酸在稻瘟病菌細(xì)胞自噬體的形成和致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　?、谟嘘P(guān)蝗綠僵菌的主要研究結(jié)果如下：
　　1）構(gòu)建了綠僵菌侵染寄主蝗蟲(chóng)體表階段的全長(zhǎng)均一化 cDNA文庫(kù)，共挑取8215個(gè)文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得7302條高質(zhì)量表達(dá)序列標(biāo)簽序列（Expressed sequence tag，EST），聚類(lèi)拼接為4739條unique ESTs，其中包括10

12、89條contigs和3650條singlets。
　　2）與綠僵菌基因組文庫(kù)的比對(duì)分析表明，4711條ESTs序列均由綠僵菌所表達(dá)，其中包括已報(bào)道的綠僵菌毒力基因。通過(guò)基因注釋和功能歸類(lèi)，對(duì)unique ESTs進(jìn)行生物學(xué)功能預(yù)測(cè)與分析，揭示了綠僵菌為適應(yīng)寄主體表環(huán)境所采用的多種基因表達(dá)策略，主要包括：降解昆蟲(chóng)體壁成分、轉(zhuǎn)運(yùn)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)至胞內(nèi)、調(diào)控碳源及氮源等代謝途徑、啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)通路、合成及重建細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、胞吞和胞泌、調(diào)節(jié)細(xì)胞

13、周期及生長(zhǎng)、對(duì)抗環(huán)境或宿主脅迫等。寄生菌-宿主相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，參與以上生物學(xué)過(guò)程的許多綠僵菌同源基因很可能編碼重要的毒力因子。
　　3）半定量分析結(jié)果表明，隨機(jī)選取的44條參與不同生物學(xué)過(guò)程的綠僵菌ESTs均在附著孢形成時(shí)期表達(dá)，其中26條ESTs在基本培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)期、蝗蟲(chóng)后翅上附著胞形成時(shí)期以及蝗蟲(chóng)血淋巴定殖時(shí)期都有表達(dá)，18條ESTs只在營(yíng)養(yǎng)匱乏的基本培養(yǎng)基和蝗蟲(chóng)后翅培養(yǎng)條件下表達(dá)，這表明綠僵菌在體表侵染階段和體內(nèi)

14、定殖階段通過(guò)差異調(diào)控某些基因來(lái)適應(yīng)不同的寄生環(huán)境。
　　4）稻瘟病菌 PLS1基因在附著胞分化形成侵染釘?shù)倪^(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。我們從所建的綠僵菌EST庫(kù)中直接克隆了綠僵菌PLS1同源基因的全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)菌落原位雜交，從綠僵菌基因組文庫(kù)中克隆了MaPLS1的全長(zhǎng)基因序列，southern雜交表明MaPLS1在綠僵菌基因組中以單拷貝形式存在。對(duì)MaPLS1蛋白的序列特征、進(jìn)化關(guān)系的分析表明，MaPLS1蛋白隸屬于真菌te

15、traspanin家族。
　　5）綠僵菌與稻瘟病菌等植物病原真菌在進(jìn)化上具有親緣關(guān)系，綠僵菌與稻瘟病菌等植物病原真菌之間基因表達(dá)的比較分析表明，綠僵菌可能采用一些類(lèi)似于植物病原真菌的基因表達(dá)策略或保守的功能基因來(lái)侵染寄主體表。
　　本文有關(guān)稻瘟病菌侵染相關(guān)的自噬分子機(jī)理、綠僵菌侵染寄主蝗蟲(chóng)體表階段的基因表達(dá)策略、以及綠僵菌與稻瘟病菌等植物病原真菌之間侵染寄主分子機(jī)制的比較研究，深化了我們對(duì)兩種病原真菌侵染機(jī)理的認(rèn)識(shí)，也為病原