稻粒黑粉病、稻曲病病原真菌快速檢測方法研究.pdf

1、稻粒黑粉病是由Tilletia horrida Tak.引起的一種至使水稻穗部發(fā)病的真菌性病害。近年來，隨著雜交水稻的大力推廣和雜交稻制種量的明顯提高，稻粒黑粉病的發(fā)生日益嚴重，尤其是雜交水稻的制種田受害最為嚴重，該病害逐漸成為水稻的主要真菌病害之一。嚴重影響雜交水稻種子的品質(zhì)和制種產(chǎn)量。對種子帶菌進行嚴格病原菌檢測，建立并實施植物檢疫制度，防止帶病的水稻種子向無病稻區(qū)去引入，從根本上防止稻粒黑粉病菌的傳播和擴散。因此，從源頭控制病害發(fā)

2、生，加強病原菌的檢測，為病害的預(yù)測預(yù)報、科學(xué)指導(dǎo)該病害的防治具有十分重要的意義。
　　稻曲病是由Ustilaginoidea virens(Cooke)Tanaka.引起的水稻谷粒真菌性病害。近年來，隨著雜交水稻高產(chǎn)品種的大力推廣和種植過程中氮肥使用水平的提高，稻曲病的田間發(fā)生逐年加重。稻曲病不但會影響水稻產(chǎn)量、降低稻米品質(zhì)，還產(chǎn)生有害毒素對人和動物造成危害。目前防治稻曲病主要還是以藥劑防治為主，因此對稻曲病菌進行嚴格監(jiān)測和預(yù)報，

3、對指導(dǎo)生產(chǎn)工作中藥劑施用具有重要意義。
　　本研究采用Real-time PCR、dd PCR、MALDI-TOF-MS三種檢測技術(shù)分別對稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子進行快速檢測方法研究。針對稻粒黑粉病和稻曲病菌孢子建立了Real-time PCR快速檢測體系;對dd PCR技術(shù)在稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子的檢測應(yīng)用進行了評估;通過MALDI-TOF-MS技術(shù)對細胞內(nèi)特征大分子物質(zhì)進行鑒定，得到稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子的特征指紋圖

4、譜。研究結(jié)果如下:
　　1、稻粒黑粉病菌孢子Real-time PCR快速檢測體系的建立?；赗eal-time PCR技術(shù)建立了稻粒黑粉病菌孢子量(y)和相應(yīng)擴增Ct值(x)的標準曲線:y=-0.2966x+10.529，(R2=0.9974，P＜0.0001)。在定量種子中摻入已知濃度稻粒黑粉病菌孢子，其Real-time PCR檢測結(jié)果與摻入孢子數(shù)存在極顯著的正相關(guān)，無顯著差異(R2=0.9329，P＜0.0001)。對Re

5、al-time PCR標準曲線進行了可靠性驗證，技術(shù)重復(fù)的變異系數(shù)在0.46％-0.95％之間，表明本方法靈敏度高重復(fù)性好。
　　2、稻曲病菌孢子Real-time PCR快速檢測體系的建立。基于Real-time PCR技術(shù)建立了稻曲病菌孢子量(y)和相應(yīng)擴增Ct值(x)的標準曲線:y=-0.2689x+10.508，(R2=0.9937，P＜0.0001)。在定量種子中摻入已知濃度稻曲病菌孢子，其Real-time PCR檢測

6、結(jié)果與摻入孢子數(shù)存在極顯著的正相關(guān)，無顯著差異(R2=0.9329，P＜0.0001)。對Real-time PCR標準曲線進行了可靠性驗證，技術(shù)重復(fù)的變異系數(shù)在0.45％-0.83％之間，該體系靈敏度高重復(fù)性好。
　　3、植物病原真菌孢子MALDI-TOF-MS檢測規(guī)范化條件的建立。本試驗從預(yù)處理方法、基質(zhì)選用和點樣方法三方面比較MALDI-TOF-MS分析結(jié)果，對影響特征圖譜的主要因素進行優(yōu)化。結(jié)果表明，稻粒黑粉病菌和稻曲病菌