NG2細(xì)胞與腦卒中的研究.pdf

1、1981年，Bill Stallcupd小組在研究神經(jīng)細(xì)胞表面抗原時(shí)，鑒定出一種介于純粹的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)特性中間的細(xì)胞系，具有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)交叉活性（NG1和NG2），NG代表（neuron/glial）神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。近年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在一類新的細(xì)胞群--NG2細(xì)胞，他們不同于神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，在其細(xì)胞表面特異性的表達(dá)NG2蛋白多糖。NG2是一種硫酸軟骨素蛋白多糖（c

2、hondroitin sulfate proteoglycan，CSPG），是由2327個(gè)氨基酸構(gòu)成的一種330kD高分子量的I型跨膜蛋白[1，2]。NG2細(xì)胞最初被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPC），后來使用新轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，NG2細(xì)胞在體內(nèi)不僅能夠生成少突膠質(zhì)細(xì)胞，而且還能產(chǎn)生原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]，以及某些情況下的神經(jīng)元[4]，推測其可能是一種神經(jīng)前體細(xì)胞

3、[5]。
　　 NG2細(xì)胞除了廣泛分布于發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，許多間充質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)NG2蛋白多糖，比如未成熟的成軟骨細(xì)胞[6]，未成熟的平滑肌細(xì)胞，發(fā)育的骨骼肌和骨，骨骼肌成肌細(xì)胞[7]，表皮干細(xì)胞，人類黑色素瘤細(xì)胞，大血管的平滑肌細(xì)胞，微血管的周細(xì)胞[8]。目前報(bào)道NG2細(xì)胞的功能特性有：分化和遷移能力；自我更新和不均一分裂的能力[9]；與神經(jīng)元形成興奮性或抑制性的突觸聯(lián)系[10，11]；記錄到長時(shí)程增強(qiáng)（long-ter

4、m potentiation，LTP），可能在突觸可塑性方面有重要功能[12]。對于NG2細(xì)胞的功能和意義目前了解的還不是很清楚，許多問題還有待進(jìn)一步深入的研究。
　　 Visfatin/Nampt是一個(gè)分子量為52 kDa的蛋白質(zhì)，含491個(gè)氨基酸，它是生命活動(dòng)中十分重要的蛋白分子。根據(jù)其先后被發(fā)現(xiàn)的功能而命名為前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子（pte-B cell colony-enhancing factor，PBEF），內(nèi)臟脂肪分泌

5、的脂肪細(xì)胞因子visfatin，哺乳動(dòng)物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）合成的限速酶--煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt）。Visfatin在體內(nèi)分布范圍很廣，并不局限于內(nèi)臟脂肪組織，在生物體內(nèi)的主要表達(dá)器官和組織有內(nèi)臟脂肪、血液有核細(xì)胞、肝組織、腦、心、脾、胰、肌肉、骨髓、肺[13]。

6、　　 Visfatin具有廣泛的生物學(xué)功能。首先，它控制著NAD的合成，極大地調(diào)控了生物體的各種生物學(xué)功能。此外，它還能促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與炎性應(yīng)答、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化[14]、抗細(xì)胞凋亡[15]、促進(jìn)血管新生[16]、參與細(xì)胞周期，調(diào)控胰島素分泌[17]等等。
　　 我們已經(jīng)證實(shí)visfatin大量表達(dá)在腦組織，而且，在缺血性腦卒中時(shí)visfatin在梗死半影區(qū)和梗死中心區(qū)表達(dá)顯著上調(diào)。使用FK866抑制visfatin后，腦缺血再

7、灌注后腦梗死面積擴(kuò)大。而加入煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）或者過表達(dá)visfatin，可以減少腦缺血再灌注損傷后腦梗死面積，表明visfatin在缺血性腦卒中時(shí)是一種重要的保護(hù)因子。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在大鼠腦缺血再灌注損傷后，梗死周圍半影區(qū)內(nèi)的NG2細(xì)胞增加，有可能分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞作為髓鞘再生細(xì)胞的來源，還有可能通過其他途徑參與缺血損傷后的腦組織的再生及修復(fù)過程[18]。
　　 目

8、前，沒有任何關(guān)于visfatin對于NG2細(xì)胞增殖能力是否有調(diào)節(jié)作用的報(bào)道，也沒有關(guān)于NG2細(xì)胞在遺傳性腦卒中模型--易卒中型高血壓大鼠（Stroke-prone
　　 spontaneously hypertensive rats，SHR-SP）上研究的報(bào)道。本課題針對visfatin在大腦中的作用，尤其是對腦缺血損傷后NG2細(xì)胞的增殖進(jìn)行了研究，此外，研究了NG2細(xì)胞在遺傳性腦卒中模型SHR-SP上的特點(diǎn)，以及visfati

9、n對其的影響作用。我們試圖尋找一種能夠引起NG2細(xì)胞增殖的激活因子，參與腦損傷的神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)，從而在腦卒中神經(jīng)再生中發(fā)揮作用。
　　 具體實(shí)驗(yàn)如下：
　　 第一部分：我們首先建立了局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?-線栓法制備的大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。我們在模型的制備過程中，對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了嚴(yán)格的控制，比如：大鼠的體重、栓線的制備、麻醉、手術(shù)操

10、作和室溫，對動(dòng)物的生理參數(shù)：血壓、血?dú)?、直腸溫度進(jìn)行了監(jiān)測并使其保持恒定，在激光多普勒血流儀的輔助下提高了模型的成功率，最后通過神經(jīng)行為學(xué)評分和TTC染色判斷模型制備的成功率和梗死體積。根據(jù)我們的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，建立了穩(wěn)定的大腦中動(dòng)脈阻塞模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行做好了準(zhǔn)備。
　　 第二部分：我們主要探討了visfatin對腦缺血損傷后NG2細(xì)胞的影響。我們已經(jīng)確認(rèn)visfatin在腦組織中確實(shí)有表達(dá)。先前預(yù)實(shí)驗(yàn)中，給正常大鼠飲水口服

11、visfatin特異性酶抑制劑--FK866（1 mg/kg/day），沒有發(fā)現(xiàn)大鼠有任何異常的行為改變。
　　 治療組大鼠進(jìn)行FK866飲水治療2周，抑制visfatin，腦片進(jìn)行免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)大腦中NG2細(xì)胞有任何改變，因此，我們得出FK866抑制visfatin后，對正常大鼠大腦內(nèi)的NG2細(xì)胞沒有影響；在腦缺血再灌注損傷后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梗死半影區(qū)的NG2細(xì)胞依然顯著增生，visfatin被FK866抑制后

12、，沒有影響到半影區(qū)NG2細(xì)胞的增殖，梗死中心區(qū)和對側(cè)區(qū)的NG2細(xì)胞與對照組相比也沒有差別。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，visfatin無論是對正常大腦內(nèi)的NG2細(xì)胞，還是腦缺血損傷后不同區(qū)域的NG2細(xì)胞變化都沒有產(chǎn)生作用。
　　 第三部分：我們對遺傳性腦卒中模型SHR-SP上的NG2細(xì)胞進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)6月齡的SHR-SP較WKY相比NG2細(xì)胞數(shù)顯著減少，但是3月齡SHR-SP與WKY之間沒有差別，顯然腦內(nèi)NG2細(xì)胞數(shù)目和SHR

13、-SP的鼠齡有關(guān)。6月齡SHR-SP大腦內(nèi)NG2細(xì)胞數(shù)顯著減少，與先前報(bào)道SHR-SP出現(xiàn)脫髓鞘改變，提示其出現(xiàn)脫髓鞘損傷可能和NG2細(xì)胞數(shù)目的減少有關(guān)。有關(guān)NG2細(xì)胞改變和SHR-SP易發(fā)腦卒中之間的聯(lián)系，我們已經(jīng)在進(jìn)一步的研究中。
　　 第四部分：Visfatin對遺傳性腦卒中模型SHR-SP上NG2細(xì)胞的作用。SHR-SP從6月齡起飲水口服FK866，因腦卒中發(fā)病而死亡的時(shí)間明顯提前，說明visfatin被FK866抑制后

14、，腦卒中的發(fā)生加快了，暗示visfatin可能有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。接下來，我們對6月齡SHR-SP給予FK866飲水兩周后，腦內(nèi)NG2細(xì)胞與對照組相比沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差別；同樣，在3月齡WKY和SHR-SP上，也未發(fā)現(xiàn)有改變。因此，根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，visfatin對遺傳性腦卒中模型SHR-SP大腦內(nèi)NG2細(xì)胞沒有作用。
　　 結(jié)論：在本論文中，我們首次證明了不管是在正常的大鼠，還是實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血模型--MCAO模型，以及