葉酸代謝通路關(guān)鍵酶基因非編碼區(qū)多態(tài)的先天性心臟病易感性研究及功能分析.pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是我國(guó)排名第一的出生缺陷，是導(dǎo)致嬰幼兒死亡和殘疾的重要原因，嚴(yán)重影響了我國(guó)的人口素質(zhì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。近年來(lái)臨床實(shí)驗(yàn)證明孕前補(bǔ)充葉酸可以顯著減低cHD的發(fā)生，由此可知葉酸及其代謝通路基因與CHD的發(fā)生關(guān)系重大。盡管國(guó)內(nèi)外在葉酸代謝基因和CHD易感性方面做了大量的研究工作，并鑒定出一些致病的多態(tài)位點(diǎn)，如MTHFR c.677 c>T、c.1298 A>C

2、等，但不同研究中結(jié)果不一致，且缺乏相關(guān)的分子生物學(xué)功能驗(yàn)證，仍有許多問(wèn)題尚待解決：(1)大多數(shù)研究將注意力集中在早期文獻(xiàn)報(bào)道的、一直以來(lái)受到廣泛關(guān)注的SNP上，而不是搜尋新的功能性致病多態(tài)，例如對(duì)MTHFR c.677 C>T、c.1298 A>C、MTRR c.66 A>G等多態(tài)的研究從十多年前持續(xù)至今，但卻始終得不到一致結(jié)果；(2)研究的基因區(qū)域側(cè)重基因編碼區(qū)，關(guān)注因氨基酸變化導(dǎo)致的基因功能異常是否會(huì)提高先心病易感性，很少對(duì)基因非編

3、碼區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)研究來(lái)探討基因劑量與CHD的關(guān)系；(3)隨著dbSNP、HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)的日益完善，研究者們傾向于根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)信息挑選tagSNP開(kāi)展自己的研究，然而不同種族、不同群體的SNP分布和頻率存在差異，完全根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)信息挑選tagSNP難免會(huì)遺漏很多重要遺傳信息；(4)先天性心臟病樣本很難收集，因此國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究樣本量都有一定局限，很少有研究募集到500例以上病例進(jìn)行遺傳學(xué)方面研究，因此效力有限，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
　　

4、 為了探討中國(guó)人群葉酸代謝途徑核心基因和CHD易感性是否存在聯(lián)系，并在研究方法上解決上述問(wèn)題，我們?cè)谏虾?、江蘇、山東三個(gè)省市收集了總計(jì)2，340例CHD病例和2，270例健康對(duì)照樣本，挑選出32個(gè)樣本對(duì)葉酸代謝途徑中甲硫氨酸合成酶(MTR)、甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)、胱硫醚β合酶(CBS)、胸苷酸合酶(TYMS)四個(gè)核心基因的啟動(dòng)子和3'UTR進(jìn)行了測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果挑選最小等位基因頻率大于10％的tagSNP，在三個(gè)人群中進(jìn)行基

5、因分型和關(guān)聯(lián)分析。在找到與疾病易感性相關(guān)的陽(yáng)性位點(diǎn)后，我們進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了功能上的分析。因?yàn)槿~酸代謝與癌癥的發(fā)生息息相關(guān)，因此我們還分析了陽(yáng)性位點(diǎn)與癌癥患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。
　　 通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，我們共找到4個(gè)非編碼區(qū)多態(tài)位點(diǎn)與先天性心臟病易感性相關(guān)，并在三個(gè)人群中得到了一致的結(jié)果，其中MTR-186 T>G(rs28372871)、+905G>A(rs1131450)、MTRR c.56 A>C(rs326119)是風(fēng)險(xiǎn)型SNP，C

6、BS-551 C>G(rs2850144)是保護(hù)型SNP。
　　 MTR基因編碼甲硫氨酸合成酶，在葉酸代謝中的主要功能是將5-甲基四氫葉酸(5m-THF)的甲基傳遞給同型半胱氨酸(HCY)，生成四氫葉酸(THF)和甲硫氨酸(MET)。該基因中的兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子分別位于啟動(dòng)子區(qū)和3'UTR區(qū)，二者均能顯著增加先心病的患病風(fēng)險(xiǎn)，其中啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)-186 T>G多態(tài)的G等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)因子，其GG基因型能增高1.56倍的患病風(fēng)險(xiǎn)(adjus

7、ted OR=1.56，95％Cl=1.33-1.83，P=1.32×10-9)。in vivo的qRT-PCR和in vitro的Luciferase實(shí)驗(yàn)證明，-186 G等位基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性低于T等位基因，我們通過(guò)軟件預(yù)測(cè)、EMSA、SPR、CHIP等手段證實(shí)了導(dǎo)致G等位基因轉(zhuǎn)錄活性低的原因是該多態(tài)T到G的變化使得啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄激活因子USF的親和力下降。另一方面從表觀遺傳學(xué)視角出發(fā)，我們發(fā)現(xiàn)-186 G等位基因的甲基化狀況比T等位

8、基因有顯著升高，因此會(huì)進(jìn)一步降低其轉(zhuǎn)錄活性。位于3'UTR的+905 G>A多態(tài)的A等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)因子，其GA、AA基因型分別能提高1.2倍和2.74倍的患病風(fēng)險(xiǎn)(GA：adjusted OR=1.2，95％Cl=1.06-1.36；AA：adjusted OR=2.74，95％Cl=2.09-3.60，P=6.35×10-14)。功能研究發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)由G到A的變化，會(huì)加大三種microRNA(miR-485、miR-608、miR-1

9、293)對(duì)MTR基因的抑制力度，在翻譯水平降低MTR的表達(dá)水平。我們還在522例健康志愿者血漿中檢測(cè)了同型半胱氨酸的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-186 G和+905 A能顯著增高體內(nèi)血漿的HCY水平。關(guān)聯(lián)分析以及HCY水平分析的結(jié)果表明這兩個(gè)SNP可以協(xié)同作用，進(jìn)一步增大CHD的患病風(fēng)險(xiǎn)。
　　 MTRR基因編碼酶的主要功能是維持足夠的活化形式的維生素B12，后者是MTR的輔酶。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性位點(diǎn)c.56+781 A>C位于MTRR第一內(nèi)

10、含子，其C等位基因會(huì)顯著提高CHD易感性，CA基因型和CC基因型分別會(huì)將CHD患病風(fēng)險(xiǎn)提高1.4倍和1.84倍(GA：ajust OR=1.4，95％Cl=1.23-1.59；CC：ajustOR=1.84，95％Cl=1.54-2.2；P=4.34×10-12)。在功能實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)心組織中MTRR mRNA的量，通過(guò)Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)in vitro檢測(cè)不同等位基因的轉(zhuǎn)錄活性，二方面的結(jié)論一致，表明c

11、.56+781 C等位基因會(huì)顯著降低轉(zhuǎn)錄活性，SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)C等位基因和核提取物物的親和力確實(shí)低于野生型的A等位基因。我們也發(fā)現(xiàn)在健康人群中CC基因型攜帶者的血漿HCY濃度要高于AA基因型。
　　 CBS的功能是通過(guò)硫化作用直接催化HCY與絲氨酸縮合成胱硫醚，是HCY釋放的途徑之一。在關(guān)聯(lián)分析中我們發(fā)現(xiàn)，位于啟動(dòng)子區(qū)的-551 C>G多態(tài)能降低CHD的患病風(fēng)險(xiǎn)，這種保護(hù)效應(yīng)隨著G等位基因數(shù)目的增加而增強(qiáng)，其CG基因型和GG基因型

12、個(gè)體分別可降低15％、40％的CHD患病風(fēng)險(xiǎn)(CG：adjustOR=0.85，95％Cl=0.75-0.96；GG：adjust OR=0.6，95％Cl=0.49-0.73；P=6.62×10-7)。通過(guò)檢測(cè)CBS的mRNA水平和luciferase報(bào)告基因驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)G等位基因的保護(hù)作用可能來(lái)源于提高的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)量。在后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)上我們發(fā)現(xiàn)-551C>G也受到了遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩方面調(diào)控，一方面c到G的變化會(huì)降低轉(zhuǎn)錄抑制因

13、子SP1與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而激活轉(zhuǎn)錄；另一方面我們檢測(cè)了-551C>G附近區(qū)域的CpG位點(diǎn)甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)G等位基因?qū)?yīng)的甲基化程度僅有C等位基因的1/7，無(wú)疑會(huì)進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄能力。
　　 以上4個(gè)多態(tài)主要圍繞葉酸代謝通路的三個(gè)重要作用，即同型半胱氨酸的移除、甲基化和DNA合成原料的提供。MTR、MTRR中三個(gè)風(fēng)險(xiǎn)多態(tài)都能大幅度降低基因的表達(dá)量，從而使得HCY在體內(nèi)堆積、THF和MET的供應(yīng)不足，這種情況在胎兒在心臟發(fā)育期間更顯

14、嚴(yán)峻，因?yàn)槠渌鷥斖緩皆谛呐K發(fā)育初期并未形成。而CBS的保護(hù)作用則強(qiáng)調(diào)了HCY在cHD發(fā)生中的風(fēng)險(xiǎn)作用，盡管有研究認(rèn)為CBS在胚胎發(fā)育初期表達(dá)量?jī)H有成人的20％，但本文中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)能大幅提高CBS的表達(dá)量，對(duì)CHD的發(fā)生有著顯著的保護(hù)作用。
　　 在實(shí)驗(yàn)中我們也對(duì)MTHFR c.677 C>T、c.1.298 A>C、MTR c.2756 A>G和MTRRc.66 A>G四個(gè)編碼區(qū)多態(tài)位點(diǎn)的進(jìn)行了分析，結(jié)果除了MTHFR c.1

15、298 A>C在山東、江蘇人群中會(huì)提高CHD患病風(fēng)險(xiǎn)之外，其他位點(diǎn)均與CHD易感性無(wú)關(guān)。將這4個(gè)編碼區(qū)多態(tài)分型信息與我們發(fā)現(xiàn)的4個(gè)非編碼區(qū)多態(tài)結(jié)果放在一起，進(jìn)行多元Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)MTR-186 T>G、+905 G>A、MTRR c.56+781 A>C、CBS-551 C>G對(duì)表型的貢獻(xiàn)是獨(dú)立的。而在HCY隊(duì)列中，通過(guò)多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，上述8個(gè)位點(diǎn)總共可以解釋中國(guó)漢族人群HCY總變異的24.6％。其中MTR-186 T