知母提取物改善3型糖尿病作用機制初探.pdf

1、知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根莖。為中國藥典收載的常用中藥之一，具有清熱瀉火，滋陰潤燥之功效。現(xiàn)代藥理研究證明知母有降糖、改善認知障礙、抗炎等功效。知母中主要為皂苷類成分，約占6％;本課題以知母提取物（主要為皂苷類）為研究對象，從TNF-α/JNK通路探討其改善3型糖尿病的作用機制，同時建立其質(zhì)量標準，為進一步將其開發(fā)為一種安全、有效、可控的降糖、改善認知障礙的藥物做準備。<

2、br>　　本文在國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及前期實驗的基礎(chǔ)上，進一步對知母提取物含量測定方法進行研究;建立知母提取物的質(zhì)量標準以及通過TNF-α/JNK通路入手，探討知母提取物改善3型糖尿病的機制研究。
　　方法:
　　1.知母有效成分的含量測定方法研究采用UV、HPLC及HPLC-ELSD，以知母皂苷BⅡ、芒果苷為對照品，測定提取物中總皂苷、總黃酮以及知母皂苷BⅡ、芒果苷的含量。
　　2.基于TNF-α/JNK通路探討知母提取物

3、改善3型糖尿病的作用機制研究。
　　雄性SD大鼠64只，SPF級，實驗分為8組，每組8只:正常組（NC組），糖尿病模型組（DM組），DM給藥組（ZDM組），復(fù)合模型組（AM組），AM給藥組(ZAM組)，癡呆模型組（AD組）、AD給藥組（ZAD組）、腦復(fù)康組（NK組）。
　　采用STZ+高脂誘導(dǎo)的2型糖尿病模型、灌胃AlCl3誘導(dǎo)的癡呆模型以及STZ+高脂+AlCl3誘導(dǎo)的復(fù)合模型，通過連續(xù)灌胃知母提取物后，分別在給藥8周、1

4、6周時，測定血漿GLU、TC、TG、INS、Aβ1-42、TNF-α、p-JNK等指標，分析其變化與Ⅱ型糖尿病及認知障礙的關(guān)系。在給藥20周結(jié)束，解剖保存大鼠各組織器官，其中大鼠腦組織、海馬組織以及胰腺做病理切片以及免疫組化實驗。
　　結(jié)果:
　　1.知母提取物質(zhì)量標準研究初步建立了知母提取物中總皂苷及總黃酮的UV含量測定方法，測的知母提取物中總皂苷含量為44.58％，總黃酮含量為7.26％。同時建立了提取物中知母皂苷BⅡ和

5、芒果苷的HPLC或HPLC-ELSD含量測定方法，知母皂苷BⅡ含量為15.12％，芒果苷含量為2.82％;
　　2.藥效學(xué)研究結(jié)果
　　a)2型糖尿病模型組與正常組相比，體重先升高，在注射STZ3周后明顯下降，而空腹血糖顯著升高(P＜0.05)，表明Ⅱ型糖尿病造模成功。
　　b)給藥8周、16周時大鼠FPG、TC、TG水平:與正常組相比，DM和AM模型組大鼠FPG、TC、TG勻顯著性升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P

6、＜0.05）;與DM和AM模型組相比，知母提取物能顯著抑制模型組FPG、TC、TG的升高(P＜0.01或P＜0.05);而AD模型組與正常組相比， FPG無顯著差異，但是TC、TG有差異(P＜0.01或P＜0.05)。
　　c)給藥8周、16周3個模型組與正常組相比，血漿Aβ蛋白、TNF-α以及p-JNK蛋白水平顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)，而知母提取物連續(xù)給藥后，可顯著降低大鼠血漿Aβ蛋白、TNF-Ⅱ以及

7、p-JNK蛋白水平(P＜0.01或P＜0.05)。
　　d)給藥20周3個模型組與正常組相比，大鼠大腦海馬區(qū)Aβ蛋白、TNF-α以及p-JNK的陽性表達率顯著上升（P＜0.01或P＜0.05），而知母提取物給藥之后，可明顯降低這3個指標在海馬區(qū)的陽性表達率（P＜0.01或P＜0.05）;
　　e)通過尼氏染色、HE染色對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元進行觀察，結(jié)果顯示正常組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，細胞體積較大，形態(tài)規(guī)則，著色均勻，

8、細胞核大而圓，尼氏小體數(shù)量多;3個模型組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，大量細胞核固縮，尼氏小體數(shù)量減少，可見固縮狀的壞死神經(jīng)元，小膠質(zhì)細胞增多;神經(jīng)元細胞排列紊亂，知母提取物給藥組海馬神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量減少，數(shù)量丟失較模型組輕，可見少量固縮狀的壞死神經(jīng)元。
　　f)胰腺組織病理結(jié)果顯示，正常組胰腺腺泡細胞均包膜完整，胰島團為圓形或卵圓形，胞核清晰，邊界清晰，每個胰島團內(nèi)細胞數(shù)量較多，胞質(zhì)豐富;3個模型組胰島細胞排列紊亂，胰島細胞壞死明顯;局

9、部炎性細胞灶性浸潤伴胰島細胞嚴重水腫，部分細胞氣球樣變，部分區(qū)域鐵血黃素沉積，部分小葉內(nèi)導(dǎo)管蛋白管型;知母提取物給藥組胰腺細胞輕度水腫，細胞排列較模型組有序，胰腺細胞壞死減輕，少量細胞氣球樣變，相對模型組有修復(fù)作用;
　　結(jié)論:
　　a)初步建立了知母提取物含量測定方法;
　　b)知母提取物對STZ+高脂誘導(dǎo)的2型糖尿病模型、灌胃AlCl3誘導(dǎo)的癡呆模型以及STZ+高脂+AlCl3誘導(dǎo)的復(fù)合模型大鼠的糖脂代謝有明顯的調(diào)