TWIST1及HHEX基因突變與先天性心臟病關(guān)系的初步研究.pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease.CHD)是胎兒時(shí)期心血管發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因異常而致的心臟血管畸形，可單獨(dú)存在，也可作為復(fù)雜畸形的一部分。CHD是人類最常見的出生缺陷，同時(shí)也是兒童非感染性疾病的主要死亡原因，發(fā)生率約占活產(chǎn)總數(shù)的1-2％。在我國(guó)，每年有約15萬(wàn)患先天性心臟病的嬰兒出生，而在西方國(guó)家先天性心臟病則是嬰兒出生后第一年的主要死亡原因。盡管大多數(shù)常見類型CHD的心臟缺陷可以通過(guò)手術(shù)方式予以糾正，但手

2、術(shù)治療會(huì)給患兒家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；同時(shí)CHD患者術(shù)后發(fā)生心臟功能異常的幾率與正常人相比會(huì)大大增加。
　　 CHD是一種復(fù)雜的心血管系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病，主要是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致。其中遺傳因素在CHD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，遺傳率為55%～65%。因其遺傳方式、外顯率等均不清楚，所以CHD致病基因尚未確定。近十年來(lái)隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，人們對(duì)心臟發(fā)育的過(guò)程及其機(jī)制有了更深入的了解。

3、　　 心臟發(fā)育不僅涉及不同時(shí)間、不同空間若干基因的先后表達(dá)，也涉及這些基因間復(fù)雜而精確的相互作用，其中任何一個(gè)基因表達(dá)質(zhì)或量的異常都可能會(huì)影響心臟發(fā)育而導(dǎo)致CHD。當(dāng)今心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子成為研究熱點(diǎn)，大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子與CHD發(fā)生密切相關(guān)。模式生物研究證實(shí)心臟轉(zhuǎn)錄因子功能異?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的先心病，其基因突變是目前先天性心臟病發(fā)病機(jī)制研究的焦點(diǎn)。
　　 TMST1是螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(bHLH)家族的主要成員，在多細(xì)胞生

4、物進(jìn)化中高度保守參與胚胎發(fā)育及疾病的發(fā)生。在脊椎動(dòng)物，TWIST1參與原腸胚及中胚層的發(fā)生。除此之外，TWIST1在哺乳動(dòng)物心臟AV通道上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，研究證實(shí)TWIST1誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程。鼠敲除模型，TWIST1()胚胎表現(xiàn)多種缺陷，包括頭顱及心臟神經(jīng)脊細(xì)胞的缺陷。因此，TWIST1在心臟神經(jīng)脊細(xì)胞發(fā)生、轉(zhuǎn)移及發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。
　　 HHEX基因位于人類10q24，全長(zhǎng)5.7 kb，包含四個(gè)外顯子，編碼2

5、70個(gè)氨基酸。同源盒基因HHEX表達(dá)于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、心臟以及中胚層。同時(shí)，作為主要心臟決定因子HHEX基因參與控制早期心臟細(xì)胞的分化、遷移與發(fā)育；而且HHEX基因通過(guò)抑制作用參與心臟發(fā)生的誘導(dǎo)。
　　 但迄今HHEX及TWIST1基因與CHD的關(guān)系還不確定，上述兩者及其他轉(zhuǎn)錄因子與心臟發(fā)育之間的相互關(guān)系，轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)調(diào)作用以及影響心臟發(fā)育的機(jī)制尚不明確，均需要進(jìn)一步研究。本文旨在探討先天性心臟病中轉(zhuǎn)錄因子HHEX及TWI

6、ST1基因突變情況以及二者基因突變對(duì)心臟形成的影響，將為CHD的早期診斷和治療探索出新的途徑。
　　 第二部分 TWIST1基因突變與先天性室間隔缺損發(fā)病的關(guān)系及其功能的初步研究
　　 目的：
　　 探討先天性室間隔缺損患者TWIST1基因突變情況；在體外初步研究TWIST1基因兩個(gè)突變點(diǎn)的生物學(xué)功能。
　　 方法：
　　 選擇196例先天性室間隔缺損患者及100例健康者，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(Pol

7、ymerase chain reaction，PCR)方法擴(kuò)增TWIST1基因第1外顯子編碼區(qū)及兩側(cè)各50個(gè)堿基以上的序列，PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)ABI PRISM3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀自動(dòng)測(cè)序，然后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中TWIST1基因的序列進(jìn)行比對(duì)，并與健康對(duì)照組比較，檢測(cè)TWIST1基因突變情況。
　　 用基因定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建突變型真核PcDNA3.1-TWIST1表達(dá)載體，在體外和E-cadherin啟動(dòng)子lucifer

8、ase報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后利用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)下游E-cadherin啟動(dòng)子-Luciferase報(bào)告基因的活性；構(gòu)建突變型真核pCMX-GAL4-TWIST1表達(dá)載體，在體外和pCMX-VP16-PCAF、TK啟動(dòng)子luciferase報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后利用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)報(bào)告基因活性。
　　 結(jié)果：
　　 1、發(fā)現(xiàn)TWIST1基因2個(gè)新的雜合子突變，分別為p.Gly8

9、3 Ser和p.Ser95Gly。在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中均未見報(bào)道且在100例對(duì)照組中也未發(fā)現(xiàn)。
　　 2、TWIST1基因編碼的第83位甘氮酸和第95位絲氨酸在生物進(jìn)化過(guò)程中均處于高度保守。
　　 3、TWIST1基因雜合子突變p.Gly83Ser和p.Ser95Gly位于TWIST1基因N-端親水基團(tuán)，同時(shí)位于TWIST1與PCAF相互作用的區(qū)域。
　　 4、突變型pcDNA3.1-TWIST1及突變型p

10、CMX-GAL4-TWIST1真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功。
　　 5、TWIST1基因Gly83Ser突變型質(zhì)粒激活下游E-cadherin luciferase報(bào)告基因的活性大約是野生型TWIST1質(zhì)粒激活下游E-cadherin luciferase報(bào)告基因活性的3倍，具有顯著性差異(t-test，p<0.01)；而TWIST1基因Ser95Gly突變型質(zhì)粒激活下游E-cadherin luciferase報(bào)告基因的活性

11、大約是野生型TWIST1質(zhì)粒激活下游E-cadherin Iuciferase報(bào)告基因活性的1.6倍，具有顯著性差異(t-test，p<0.05)。結(jié)果提示TWIST1突變體降低了TWIST1抑制E-cadherin的作用。
　　 6、TWIST1基因Gly83Ser突變型質(zhì)粒與PCAF相互作用后激活TK報(bào)告質(zhì)粒的活性大約是野生型TWIST1質(zhì)粒激活TK報(bào)告質(zhì)?；钚缘?2%，具有顯著性差異(t-test，p<0.01)；而TWI

12、ST1基因Ser95Gly突變型質(zhì)粒與PCAF相互作用后激活TK報(bào)告質(zhì)粒的活性大約是野生型TWIST1質(zhì)粒激活TK報(bào)告質(zhì)粒活性的77%，具有顯著性差異(t-test，p<0.05)。結(jié)果提示TWIST1突變體降低了TWIST1與PCAF的相互作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、轉(zhuǎn)錄因子TWIST1基因突變可能與中國(guó)散發(fā)型先天性室間隔缺損的發(fā)病相關(guān)。
　　 2、應(yīng)用基因定點(diǎn)突變的方法成功構(gòu)建了 PcDNA3.1-TWI

13、ST1及Pcmx-GAL4-TWIST1突變型真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 3、在體外實(shí)驗(yàn)中，TWIST1基因Gly-83 Ser和Ser95Gly雜合子突變影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性；同時(shí)降低了TWIST1與PCAF相互作用，提示Gly83Ser和Ser95Gly雜合突變影響了TWIST1基因蛋白質(zhì)生物功能。
　　 第二部分先天性心臟病患兒HHEX基因的突變檢測(cè)
　　 目的：
　　 探討先天性心臟病患兒HHEX基

14、因突變情況。
　　 材料與方法：
　　 選擇296例先天性心臟病患者及200例健康者，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechain reaction，PCR)方法擴(kuò)增HHEX基因4個(gè)外顯子編碼區(qū)及兩側(cè)各50個(gè)堿基以上的序列，PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)ABI PRISM3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀自動(dòng)測(cè)序，然后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中HHEX基因的序列進(jìn)行比對(duì)，并與健康對(duì)照組比較，篩察HHEX基因突變情況。
　　 結(jié)果：