MicroRNA-221靶向Ets-1調(diào)控血管緊張素Ⅱ致腎間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、目的：⑴觀察不同纖維化程度腎穿刺病理標(biāo)本及AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠腎臟病變中細(xì)胞外基質(zhì)及Ets-1表達(dá)的變化。⑵觀察AngⅡ刺激體外培養(yǎng)正常大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株NRK-49F中Ets-1表達(dá)及受到siRNA抑制后細(xì)胞功能學(xué)及細(xì)胞外基質(zhì)的改變，探討Ets-1在AngⅡ致成纖維細(xì)胞激活中作用。⑶檢測AngⅡ誘導(dǎo)的腎臟纖維化模型及AngⅡ刺激NRK-49F后miRNA的變化。⑷從microRNA調(diào)控水平，對Ets-1作用機(jī)制進(jìn)行深一步探討。

2、>　　方法：以CD1小鼠為研究對象，采用皮下埋置含AngⅡ的滲透性微泵建立慢性腎損傷模型，對照組通過滲透微型泵持續(xù)泵入生理鹽水。以Balb/c小鼠為研究對象，采用尾靜脈注射AngⅡ質(zhì)粒建立慢性腎損傷模型，對照組尾靜脈注射空質(zhì)粒。分別于第14、28天收集標(biāo)本。常規(guī)病理切片觀察腎臟病理，免疫組化及Western blot方法觀察組織中Ets-1、α平滑肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)的表達(dá)。同時以NRK-49F細(xì)胞作為實驗對象，

3、用不同濃度AngⅡ刺激NRK-49F及轉(zhuǎn)染Ets-1 siRNA后，MTT法檢測細(xì)胞增殖，Transwell檢測細(xì)胞遷移，蛋白免疫印跡、PCR及免疫熒光觀察觀察Ets-1、FN、αt-SMA的表達(dá)。探討Ets-1在AngⅡ致成纖維細(xì)胞激活中作用。同時qPCR檢測AngⅡ誘導(dǎo)的慢性腎損傷模型及AngⅡ刺激NRK-49F后miR-221的變化。將miR-221前體和抑制物轉(zhuǎn)染NRK-49F細(xì)胞，觀察細(xì)胞遷移及Ets-1、FN、α-SMA蛋白

4、表達(dá)變化。SigmaStat軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析實驗結(jié)果，SigmaPlot軟件表達(dá)結(jié)果。
　　結(jié)果：①皮下埋置含AngⅡ的滲透性微泵及尾靜脈注射AngⅡ質(zhì)粒均能誘導(dǎo)小鼠腎小管間質(zhì)纖維化。腎組織FN和α-SMA表達(dá)增多。②Ets-1在AngⅡ誘導(dǎo)的慢性腎損傷模型中表達(dá)上調(diào)。③AngⅡ能激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖、遷移能力增強(qiáng)及FN和α-SMA表達(dá)增多，該過程中Ets-1表達(dá)上調(diào)呈時間及劑量依賴關(guān)系。④Ets-1 siRNA

5、可以拮抗AngⅡ?qū)?xì)胞的激活作用。⑤篩選不同時間點AngⅡ刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的microRNA表達(dá)變化，其中miR-221呈現(xiàn)持續(xù)性降低趨勢，qPCR驗證在體內(nèi)及體外實驗中miR-221均表達(dá)降低。⑥pre-miR-221使細(xì)胞高表達(dá)miR221，同時Ets-1蛋白表達(dá)降低，拮抗AngⅡ激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的作用，anti-pre-miR-221使細(xì)胞miR221表達(dá)降低，ETs-1蛋白表達(dá)增高，加重細(xì)胞損害。
　　結(jié)論：⑴Et