FLK-1陽性表達(dá)的胎肝多能干細(xì)胞移植治療急性肝損傷的療效探討.pdf

1、目的：探討胎肝FLK-1+胎肝細(xì)胞特征和功能，觀察胎肝FLK-1+胎肝細(xì)胞輸注治療四氯化碳構(gòu)建的昆明小鼠急性肝損傷模型的療效，并其對肝臟損傷修復(fù)作用機(jī)制。
　　 方法：采用免疫磁珠提取胎肝FLK-1+細(xì)胞。體外應(yīng)用HGF和EGF誘導(dǎo)后，采用FACS檢測細(xì)胞因子誘導(dǎo)前后胎肝FLK-1+細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)變化，RT-PCR檢測細(xì)胞因子誘導(dǎo)前后其干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)情況。以四氯化碳作為肝臟毒劑，構(gòu)建昆明小鼠急性肝損傷模型，并將昆明小鼠急性

2、肝損傷模型隨機(jī)分為2組：對照組20只昆明種小鼠經(jīng)鼠尾靜脈途徑輸入輸入生理鹽水；實驗組20只昆明種小鼠，經(jīng)鼠尾靜脈途徑輸入HGF和EGF誘導(dǎo)的FLK-1陽性細(xì)胞(1×106細(xì)胞)。16小時后取血測定肝功能、計算64小時死亡率，分別將各組小鼠肝臟取出后立即經(jīng)4℃4％多聚甲醛液固定24h，石蠟包埋和切片，并做常規(guī)HE染色，觀察各臟器的組織病理變化。用統(tǒng)計軟件SPSS19.0計算和比較兩組肝功能指標(biāo)和死亡率的差異。
　　 結(jié)果：1.從懷

3、孕第17.19天的C57BL/6小鼠中提取胎鼠的單個肝細(xì)胞懸液浮經(jīng)臺盼藍(lán)拒染法顯示，細(xì)胞活力均超過95％。采用免疫磁珠方法分離的胎肝FLK-1+細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞分析儀檢測顯示，胎肝FLK-1+細(xì)胞純度超過98％。
　　 2.胎鼠肝臟FLK-1+細(xì)胞極少數(shù)表達(dá)白蛋白(陽性率為0.6％)，經(jīng)HGF和EGF誘導(dǎo)后96.38％的FLK-1+細(xì)胞表達(dá)白蛋白，獲得了肝細(xì)胞的表型特征。另外，RT-PCR檢測FLK-1+細(xì)胞高表達(dá)Oct-3/4、

4、Rex-1，而經(jīng)肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)5d后FLK-1不表達(dá)，Oct-3/4和Rex-1表達(dá)均明顯下降或消失，提示其失去了干細(xì)胞特征。
　　 3.將99.9％四氯化碳用花生油稀釋成0.4％、4％、40％等三個工作濃度，每個濃度組10只昆明種小鼠，生化檢測結(jié)果顯示：隨著四氯化碳濃度的升高，AST、ALT、TBIL指標(biāo)明顯升高，存在濃度依賴性(p<0.05)；而ALB、FIG隨著四氯化碳濃度的升高而下降，也存在濃度依賴性，與四氯化碳濃度

5、呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)。并且，僅有40％濃度組導(dǎo)致小鼠死亡，80％(8/10)小鼠均在16小時內(nèi)死亡，其中8小時內(nèi)死亡4只，其余在8-16小時時間段死亡。
　　 4.胎鼠肝臟FLK-1+細(xì)胞移植后16小時對照組小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，4095 IU/L±1240 IU/L)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，3085 IU/L±1200 IU/L)均明顯高于實驗組(AST，1614IU/L±814IU/L，ALT，1714 IU/L±9

6、90 IU/L)，但對照組小鼠血清白蛋白(18.6±1.4)明顯低于實驗組(27.0±3.2)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；對照組和實驗組小鼠血清總膽紅素和纖維蛋白原的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。對照組死亡率約為80％，移植組死亡率為61.5％，略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　 結(jié)論：1.FLK-1可用于富聚胎肝未分化細(xì)胞。
　　 2.胎鼠肝臟FLK-l+細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-3