基于線粒體COI序列建立稻田蛀稈螟蟲DNA條形碼的可行性研究.pdf

1、稻田蛀稈螟蟲種類繁多，且田間調(diào)查大都是幼蟲和蛹，常給田間蟲情測報(bào)帶來困難。分子鑒定為解決這一難題提供了新途徑，尤其是條形碼技術(shù)，可以設(shè)計(jì)一對引物克隆一個(gè)特定類群生物的特定DNA片段，通過測序分析，簡便的區(qū)分出不同的物種和種下類群。但要建立DNA條形碼物種識(shí)別技術(shù)，首先必須選擇適宜的編碼基因序列。為此本研究采集了大田常見的7種蛀稈螟蟲，以及不同地理種群的二化螟和不同寄主植物上的大螟做為試蟲，就利用COI基因序列建立稻田蛀稈螟蟲簡易分子鑒定

2、方法的可行性進(jìn)行了研究，現(xiàn)將具體工作和研究成果總結(jié)如下:
　　首先利用已有資料設(shè)計(jì)特異性引物，克隆了吉林，安徽，浙江，湖南，湖北和四川6個(gè)不同地理種群55頭二化螟的線粒體COI基因，通過序列比對和遺傳距離分析，揭示二化螟不同地理種群間的變異度。結(jié)果顯示，選用的特異引物可以從二化螟中穩(wěn)定的克隆出709 bp的COI基因序列，所克隆的序列片段具有51個(gè)變異位點(diǎn)，沒有缺失和插入現(xiàn)象。利用進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同地理種群沒有明顯的獨(dú)立聚類，種

3、群間的遺傳距離為0.006～0.012，與種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳距離相當(dāng)(0～0.02)。表明所克隆的二化螟COI基因片段具有適宜的變異信息，不同地理種群之間雖有一定分化，但遺傳距離較小，不會(huì)影響編碼序列的條形碼功能。
　　同樣方法克隆比較了小麥、菵草、水稻和香根草等4種寄主植物上33頭大螟的線粒體COI基因，發(fā)現(xiàn)選用的特異引物同樣可以從大螟中穩(wěn)定的克隆出同樣是709bp的COI基因序列。大螟該段COI基因片段中也沒有缺失和插入現(xiàn)象，

4、但具有125個(gè)變異位點(diǎn)，明顯多于二化螟。通過序列分析不同寄主上采集樣本個(gè)體的COI基因變異發(fā)現(xiàn)，同一寄主上的大螟個(gè)體之間變異較小，遺傳距離在0～0.027之間;不同寄主之間，水稻、小麥和藺草上大螟樣本的遺傳距離也較小，僅為0.026～0.029，但香根草上的大螟與其他三種寄主上的差異較大，遺傳距離達(dá)到0.128～0.140。利用進(jìn)化樹分析同樣證實(shí)，香根草上的大螟單獨(dú)聚類為一支，與其他三種寄主上大螟混合聚類的一支明顯分離。表明香根草上的大

5、螟很可能是不同的寄主型甚至隱存種。另一方面也證實(shí)，該COI基因片段可以作為大螟條形碼研究的編碼序列，即使存在“香根草隱存種”，由于遺傳距離差異顯著，也不會(huì)影響對稻田蛀稈螟蟲的鑒定。
　　利用同樣方法克隆了二化螟、臺(tái)灣稻螟、蘆苞螟、甘蔗條螟、大螟、三化螟和玉米螟等7種37頭常見蛀稈螟蟲的COI基因，通過序列比對和遺傳距離分析，揭示不同蛀稈螟蟲的種間和種內(nèi)的遺傳變異度。結(jié)果顯示，選用的特異引物可以從所試各種螟蟲中穩(wěn)定的克隆出709 b

6、p的基因序列。序列比對和堿基組成分析證實(shí)，所克隆的序列片段是COI基因片段，其中包含199個(gè)變異位點(diǎn)，沒有缺失和插入現(xiàn)象。計(jì)算種間遺傳距離(0.86～1.54)顯著大于種內(nèi)個(gè)體間遺傳距離(0.000～0.047)。利用進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同螟蟲均獨(dú)立聚類，且表現(xiàn)出一定的親緣關(guān)系。討論認(rèn)為，選用的特異性引物適合克隆各種蛀稈螟蟲的COI基因，且所克隆的螟蟲COI基因片段具有適宜的變異信息，種內(nèi)相對保守，種間變異顯著，適合用做條形碼編碼序列。<