十全大補(bǔ)湯總多糖免疫抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究十全大補(bǔ)湯總多糖的免疫抑瘤作用。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量十全大補(bǔ)湯總多糖成分對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)、脾臟T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖及其產(chǎn)生IL-2、IFN等細(xì)胞因子水平的影響；同時(shí)以敏感化療藥物作為對(duì)照，觀察其總多糖成分與化療藥物是否具有協(xié)同抑瘤作用及免疫增強(qiáng)作用；觀察十全大補(bǔ)湯總多糖成分在體外的抑瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：本研究包括體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)

2、腸癌細(xì)胞HT-8和人肝癌細(xì)胞Bel-7402。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×104/ml，同時(shí)無(wú)菌操作取正常小鼠脾細(xì)胞，用含10％牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×106/ml，分別接種于96孔培養(yǎng)板（90μl/孔）。用MTT方法檢測(cè)不同濃度十全大補(bǔ)湯總多糖（200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml）對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常脾細(xì)胞增殖的影響。
　　 體

3、內(nèi)實(shí)驗(yàn)：昆明種小鼠50只，每只左側(cè)腋窩皮下接種H22肝癌細(xì)胞（5×106/ml）0.2ml。接種腫瘤細(xì)胞后隨機(jī)分為5組，每組10只：1組為荷瘤對(duì)照組，2組為化療組，3組為高劑量多糖加化療組，4組為中劑量多糖加化療組，5組為低劑量多糖加化療組。各組小鼠于接種腫瘤后24小時(shí)開(kāi)始給藥：1組每只腹腔注射生理鹽水0.2ml，0.5ml白開(kāi)水灌胃；2組每只腹腔注射順鉑（2mg/kg），0.5ml白開(kāi)水灌胃；3、4、5組小鼠在每只腹腔注射順鉑（2mg

4、/kg）的同時(shí)分別給予0.5ml濃度為168mg/ml、84mg/ml及42mg/ml的多糖灌胃，連續(xù)給藥10天。于停藥后24小時(shí)，將小鼠處死，剝離瘤塊稱重，計(jì)算腫瘤抑制率；取脾臟稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)；分離脾細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)脾臟T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖活性，ELISA方法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-2的水平；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）及血紅蛋白（HGB）的變化。
　　 實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.1十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用
　　 各劑量多糖組在培養(yǎng)24h和48h后對(duì)人肺癌細(xì)胞A549都有明顯的抑制作用，在培養(yǎng)后24h，200ug/ml和100ug/ml多糖組的OD值明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；在培養(yǎng)后48h，50ug/ml、25ug/ml和12.5 ug/ml多糖組的OD值明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；在培養(yǎng)后72h，200ug/m

6、l、100ug/ml及50ug/ml的多糖對(duì)A549有明顯抑制作用（P<0.05），而25 ug/ml、12.5ug/ml的多糖對(duì)A549無(wú)明顯抑制作用。
　　 1.2十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402的抑制作用
　　 各劑量多糖組在培養(yǎng)12h后對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402均無(wú)抑制作用。在培養(yǎng)48h后，200ug/ml、100ug/ml和50 ug/ml多糖組的OD值均明顯低于對(duì)照組（P<0.05），其它劑量多

7、糖組的OD值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；在培養(yǎng)72h后，各劑量多糖組的OD值均明顯低于對(duì)照組（P<0.05），除外12.5ug/ml組其余抑制作用尤為明顯（P<0.01）。
　　 1.3十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-8的抑制作用
　　 各劑量多糖組在培養(yǎng)24h后，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-8均無(wú)抑制作用。在培養(yǎng)48 h后，200ug/ml、100ug/ml和25ug/ml多糖組的OD值均明顯低于對(duì)照組（P<0.05），其它

8、劑量多糖組的OD值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；在培養(yǎng)72h后，200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml多糖組的OD值均明顯低于對(duì)照組（P<0.05），其它劑量組的OD值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；50ug/ml組抑制作用尤為明顯（P<0.01）。
　　 1.4十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖的刺激作用
　　 各劑量多糖組在培養(yǎng)24h后對(duì)脾細(xì)胞的增殖均無(wú)刺激作用。在培養(yǎng)48 h后，100ug/ml和50ug/ml

9、多糖組的OD值明顯高于對(duì)照組（P<0.05），其它劑量多糖組的OD值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；在培養(yǎng)72h后，200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml和25ug/ml多糖組的OD值均明顯高于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明在培養(yǎng)72h后多糖在體外可刺激脾細(xì)胞的增殖，且以100ug/ml，50ug/ml多糖組的效果最好。
　　 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 2.1十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠體重生長(zhǎng)作用
　　 順鉑

10、可使荷瘤小鼠的體重增長(zhǎng)受到抑制，各劑量的多糖對(duì)荷瘤小鼠的體重增長(zhǎng)沒(méi)有明顯的改善作用。
　　 2.2十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用
　　 對(duì)照組、順鉑組、高劑量多糖加順鉑組、中劑量多糖加順鉑組和低劑量多糖加順鉑組腫瘤重量分別為：（1.35±0.33）克、（1.05±0.21）克、（0.87±0.28）克、（0.85±0.25）克和（1.05±0.27）克。各組小鼠的腫瘤與對(duì)照組小鼠的腫瘤比較，腫瘤重量明顯降低

11、（P<0.05）。高、中劑量多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用組荷瘤小鼠的腫瘤重量較順鉑組小鼠的腫瘤顯著降低（P<0.05），而低劑量多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用組的腫瘤重量與順鉑組比較無(wú)顯著差異。
　　 2.3十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾指數(shù)的影響
　　 順鉑可使荷瘤小鼠的脾指數(shù)下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.01），順鉑與高、中劑量十全大補(bǔ)湯總多糖聯(lián)合應(yīng)用組荷瘤小鼠的脾指數(shù)明顯高于順鉑組（P<0.05），但仍低于腫瘤對(duì)照組而低劑量十全

12、大補(bǔ)湯總多糖組的脾指數(shù)與順鉑對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。
　　 2.4十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠外周血WBC、RBC和HBG的影響
　　 順鉑組荷瘤小鼠的白細(xì)胞較荷瘤對(duì)照組顯著下降（P<0.05），而高劑量多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用使小鼠的白細(xì)胞明顯提高，與順鉑組比較有顯著性差異（P<0.05），中、低劑量多糖加順鉑組小鼠的白細(xì)胞也較順鉑組明顯提高（P<0.05）。說(shuō)明十全大補(bǔ)湯總多糖能減輕順鉑對(duì)白細(xì)胞的損傷作用。紅細(xì)胞和血紅蛋白在

13、順鉑組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異，但中劑量十全大補(bǔ)湯總多糖組血紅蛋白和紅細(xì)胞數(shù)較順鉑對(duì)照組有顯著提高（P<0.05）。
　　 2.5十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟T細(xì)胞增殖的影響
　　 順鉑可使荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)降低，與腫瘤對(duì)照組比較P<0.05，順鉑與高、中劑量多糖組T細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于順鉑組和腫瘤對(duì)照組（P<0.01），順鉑與低劑量多糖組的T細(xì)胞刺激指數(shù)也分別高于腫瘤對(duì)照組和順鉑對(duì)照組（P<0.05），結(jié)

14、果說(shuō)明，十全大補(bǔ)湯總多糖可拮抗順鉑的免疫抑制作用，提高荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力，提高荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。
　　 2.6十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟B細(xì)胞增殖的影響
　　 順鉑可使荷瘤小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)降低，與腫瘤對(duì)照組比較P<0.05，順鉑與高劑量多糖組B細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于順鉑組（P<0.01），且高于腫瘤對(duì)照組（P<0.01），順鉑與中劑量多糖組的B細(xì)胞刺激指數(shù)也分別高于腫瘤對(duì)照組和順鉑對(duì)照組（

15、P<0.05），結(jié)果說(shuō)明，十全大補(bǔ)湯總多糖可拮抗順鉑的免疫抑制作用，提高荷瘤小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖能力，提高荷瘤機(jī)體的體液免疫功能。
　　 2.7十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌的影響
　　 順鉑組荷瘤小鼠的IFN-γ與荷瘤對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，各劑量組多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用使荷瘤小鼠的IFN-γ明顯升高，與順鉑組比較也明顯升高，多糖劑量越高，IFN-γ的含量升高越明顯。
　　 2.8十全大補(bǔ)湯總多糖

16、對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2的影響
　　 順鉑組荷瘤小鼠的IL-2水平較荷瘤對(duì)照組無(wú)明顯變化，各劑量組多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用使荷瘤小鼠的IL-2明顯升高。以中、低劑量多糖組的作用效果較好。
　　 結(jié)論：
　　 1.十全大補(bǔ)湯總多糖在體外對(duì)腫瘤有抑制作用，作用效果與其劑量、瘤株類型、作用時(shí)間有關(guān)。
　　 2.十全大補(bǔ)湯總多糖在體外可刺激小鼠脾細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 3.十全大補(bǔ)湯總多糖可以