成骨誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與AW生物活性玻璃陶瓷多孔支架材料復(fù)合的體內(nèi)外研究.pdf

1、臨床上由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染以及發(fā)育異常等原因而導(dǎo)致的骨缺損發(fā)病率較高。骨缺損是指由于外傷、感染、腫瘤切除等因素造成骨質(zhì)喪失，從而在骨組織中形成間隙。較小范圍的骨缺損可以由機(jī)體自身的再生得到修復(fù)，而較大間隙的骨缺損則由于成骨細(xì)胞難以越過而不能正常愈合，若不采用適當(dāng)治療則最終僅由纖維組織充填，形成骨不連。有研究表明，當(dāng)長骨骨干缺損長度超過其直徑的1.5～2.5倍時(shí)，機(jī)體便難以自行愈合，因而造成永久性骨不連。骨缺損的病人在骨科患者中占

2、有很高的比例，大約有10～15％的病人需要進(jìn)行骨移植治療。如何利用現(xiàn)代高科技，研究用于骨缺損修復(fù)的生物材料，解除患者痛苦，是骨科臨床和生物材料研究者們關(guān)注的課題。 骨組織工程學(xué)是利用組織工程學(xué)原理對(duì)骨缺損進(jìn)行修復(fù)或重建的一門學(xué)科。近年來，將種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，在體外構(gòu)建生物復(fù)合材料是骨組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)。理想的生物復(fù)合材料應(yīng)在保證材料力學(xué)性能的同時(shí)，具有良好的生物相容性和多孔相通性，以支持細(xì)胞的生長和功能的表達(dá)，為血管、神

3、經(jīng)的生長，營養(yǎng)物質(zhì)的輸送以及代謝產(chǎn)物的排出提供空間，促進(jìn)骨組織的生長。目前應(yīng)用較廣泛的種子細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs），其作為組織工程的優(yōu)秀種子細(xì)胞之一，具有很強(qiáng)的成骨分化潛力，在誘骨環(huán)境下能夠被誘導(dǎo)分化成為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨修復(fù)過程，因此被廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。而支架材料多選用生物活性材料及生物復(fù)合材料。近年來，將細(xì)胞與特定支架材料聯(lián)合培養(yǎng)，形成具有生命的活性組織工程化復(fù)合材料用于

4、修復(fù)骨缺損已經(jīng)取得了初步成效，但許多研究表明，單純的MSCs與材料的復(fù)合物誘導(dǎo)骨化過程很慢，毫無疑問，如何構(gòu)建更理想的組織工程化人工骨已成為一個(gè)值得被重視的熱點(diǎn)。 方法 1．在本實(shí)驗(yàn)前期工作中，我們已采用密度梯度離心法分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rat mesenchymal stem ceils，rMSCs），誘導(dǎo)其向成骨方向分化，并挑選出處于最佳時(shí)期的細(xì)胞作為種子細(xì)胞。用溶膠凝膠法制備前驅(qū)體粉末，以硬脂酸為成孔劑

5、，經(jīng)混料、模壓成型、干燥及高溫?zé)Y(jié)步驟制備AW生物活性玻璃陶瓷多孔支架材料；分別選用不同孔隙率、不同孔徑和不同粗糙度的支架材料與種子細(xì)胞（成骨誘導(dǎo)后的rMSCs）復(fù)合，通過比較不同支架材料對(duì)種子細(xì)胞生長、增殖以及分化的影響來篩選最佳工藝參數(shù)的支架材料。 2．將成骨誘導(dǎo)后的rMSCs／材料復(fù)合物，未誘導(dǎo)的rMS／材料復(fù)合物以及單純的支架材料分別植入到裸鼠大腿肌袋內(nèi)，觀察他們?cè)隗w內(nèi)異位成骨的情況，以挑選體內(nèi)成骨能力最強(qiáng)的新型生物復(fù)合

6、材料。 3．使用密度梯度離心法分離成年犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，保留貼壁細(xì)胞傳代，觀察，測(cè)試在培養(yǎng)液中添加地塞米松（Dex）10<-18>mol/L，β-甘油磷酸鈉（β-GP）10mmol/L，抗壞血酸（AA）50~ug/ml條件下誘導(dǎo)犬MSC體外分化為成骨細(xì)胞，利用倒置光學(xué)顯微鏡，透射電鏡，四甲基偶氮鹽（MTT）比色，堿性磷酸酶（ALP）活性，骨鈣素（OCN）含量測(cè)定等方法研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化情況。 4．

7、在前述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)化及AW多孔支架復(fù)合材料制各和性能研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行了成骨誘導(dǎo)犬自體MSCs／AW多孔支架材料復(fù)合體體外構(gòu)建，修復(fù)實(shí)驗(yàn)性節(jié)段性骨缺損，X光片觀察復(fù)合材料在體內(nèi)骨缺損處的結(jié)合情況，探討其骨缺損修復(fù)能力。該部分實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中。 結(jié)果 1．AW多孔支架復(fù)合材料具有良好的生物相容性；硬脂酸加入量為30wt％、粒徑為20～30目的AW多孔支架材料其孔隙率達(dá)67％，孔徑600～850μm，抗壓強(qiáng)度達(dá)15.3MP

8、a，其更有利于細(xì)胞的生長和成骨功能的表達(dá) 2．裸鼠肌袋異位誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)顯示：與單純的支架材料以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞材料復(fù)合物相比，成骨誘導(dǎo)后的rMSCs與材料復(fù)合后制備的新型生物復(fù)合材料在裸鼠肌袋內(nèi)具有更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)和異位成骨能力，提示其具有良好的成骨潛能，作為新型骨組織工程生物復(fù)合材料。而rMSCs在裸鼠肌袋內(nèi)具多向分化潛能，是否能作為骨組織工程種子細(xì)胞尚待商榷。 3．形態(tài)學(xué)觀察表明，犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（canine me

9、senchymal stemcells，cMSCs）貼壁細(xì)胞呈集落生長，有成纖維細(xì)胞樣外觀，透射電鏡可見成骨誘導(dǎo)后cMSCs具有分泌型細(xì)胞的特征；推測(cè)成骨誘導(dǎo)劑可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，表現(xiàn)為ALP活性、OCN含量明顯升高。本實(shí)驗(yàn)表明所培養(yǎng)的cMSCs保持了未分化狀態(tài)，并在成骨誘導(dǎo)劑的作用下可向成骨細(xì)胞分化。 4．該實(shí)驗(yàn)尚未完成，其X光片結(jié)果初步顯示成骨誘導(dǎo)后MSCs／AW支架材料在體內(nèi)骨愈合情況較好。其成骨作用有待