鯉魚RLR基因克隆及其免疫功能研究.pdf

1、鯉魚(Cyprinus carpioL.)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類,由于其含有較高的營(yíng)養(yǎng)成分,且具有一定的藥用價(jià)值,因而倍受人們喜愛。但是隨著養(yǎng)殖密度的增高,而水體中含有較多且復(fù)雜的微生物群,鯉魚中會(huì)常出現(xiàn)由病毒或細(xì)菌引起的疾病,成為生產(chǎn)中面臨的主要問題之一。鯉魚作為一種低等的脊椎動(dòng)物,與哺乳動(dòng)物相比,特異性免疫系統(tǒng)還不夠發(fā)達(dá),因此主要依靠天然免疫系統(tǒng)抵抗外來入侵的病原微生物。
　　天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原微生物入侵的首道防線,

2、機(jī)體通過模式識(shí)別受體(PRRs)來識(shí)別包括TLRs、NLRs和RLRs在內(nèi)的病原相關(guān)分子模式(PAMPs),誘導(dǎo)干擾素及促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。RLR家族是2004年新發(fā)現(xiàn)的一類PRR,有三個(gè)成員,包括RIG-I、MDA5和LGP2。RIG-I和MDA5的CARD結(jié)構(gòu)域與IPS-1的CARD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,從而激活其下游信號(hào)分子,啟動(dòng)IRF3∕7和NF-κB信號(hào)通路。LGP則作為正調(diào)控因子參與RLR抗病毒信號(hào)通路。
　　本研究通過設(shè)計(jì)

3、引物,利用半定量RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了鯉魚MDA5和LGP2,并運(yùn)用生物信息學(xué)分析其蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系,使用Real-time PCR檢測(cè)分析正常鯉魚及經(jīng)過polyI:C注射刺激的鯉魚各個(gè)組織中MDA5和LGP2 mRNA表達(dá)量變化,研究其在鯉魚抗病毒天然免疫過程中發(fā)揮的作用。
　　鯉魚MDA5 cDNA全長(zhǎng)3851 bp,編碼993個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)鯉魚MDA5氨基酸序列包含六個(gè)結(jié)構(gòu)域:1個(gè)CARD、1個(gè)DExDc、1個(gè)R

4、esIII、2個(gè)HELICc和1個(gè)RD。鯉魚MDA5mRNA在被測(cè)組織中均有表達(dá),在鰓和脾臟中表達(dá)量最高,其次是皮膚、腦、肌肉和后腸,而在性腺和血液中的表達(dá)量較低。與注射PBS的對(duì)照相比,經(jīng)poly I:C注射刺激的鯉魚各個(gè)組織中MDA5 mRNA的表達(dá)量明顯升高。肝臟中MDA5在3 h就有明顯上升,注射后6 h達(dá)到最高值(86.3倍,P﹤0.05),1d又恢復(fù)到原來水平;脾臟中MDA5在6h達(dá)到最高值(18.8倍,P﹤0.05),且一

5、直維持到12h,1d開始有明顯降低,注射后2d恢復(fù)到正常水平;頭腎中3h有明顯升高,6 h達(dá)到最高值(24.1倍,P﹤0.05),注射后3d其mRNA表達(dá)量才恢復(fù)到原來水平;在皮膚和鰓中,MDA5表達(dá)量都是在6小時(shí)達(dá)到峰值(26.8倍和139.3倍,P﹤0.05),注射后2d恢復(fù)到正常水平;前腸和后腸中,MDA5在3h表達(dá)量顯著上升,前腸升高500.2倍,后腸升高15.0倍,注射后6h表達(dá)量開始有明顯降低(P﹤0.05)。
　　L

6、GP2 cDNA全長(zhǎng)2978bp,編碼679個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)鯉魚LGP2氨基酸序列包含五個(gè)結(jié)構(gòu)域:2個(gè)DExDc、1個(gè)ResIII、1個(gè)HELICc和1個(gè)RD。LGP2 mRNA在被測(cè)組織中均有廣泛的表達(dá),在鰓、腦和脾中表達(dá)量最高,在口腔上皮、性腺和血液中的表達(dá)量最低。與注射PBS的對(duì)照相比,經(jīng)poly I:C注射刺激的鯉魚各個(gè)組織中LGP2 mRNA的表達(dá)量明顯升高。LGP2在肝臟中3 h達(dá)到最高值(175.3倍,P﹤0.05),注射后

7、2d恢復(fù)到正常水平;脾臟中,注射3 h就有明顯上升,12h達(dá)到峰值(55.5倍,P﹤0.05),注射后3d恢復(fù)到正常水平;頭腎中LGP2表達(dá)量3h開始有顯著上升,6h達(dá)到峰值(77.2倍,P﹤0.05),12h有所下降,1d恢復(fù)到正常水平;皮膚中6h達(dá)到峰值(54.6倍,P﹤0.05),注射后3d恢復(fù)到正常水平;鰓中LGP2表達(dá)量在12h達(dá)到峰值(57.5倍,P﹤0.05)1d突然降低;前腸和后腸中,LGP2 mRNA表達(dá)量都是在3h達(dá)