NDVF和IBDV VP2多表位串聯(lián)苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫的初步比較.pdf

1、 I中文摘要新城疫(ND)和傳染性法氏囊病( IBD)是危害養(yǎng)禽業(yè)的兩大疾病，其死亡率高，能夠造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是預(yù)防這兩種疾病的有效手段。目前疫苗的使用使這兩種病得到一定的控制。 但是也存在著 ND 多次免疫仍出現(xiàn)非典型ND 現(xiàn)象，IBD 也出現(xiàn)強(qiáng)毒株的感染，屢屢導(dǎo)致免疫失敗。當(dāng)前，多表位疫苗是研究熱點(diǎn)之一。與傳統(tǒng)疫苗相比，其應(yīng)用性和可操作性極大，表位的聯(lián)合、修飾或改造在質(zhì)粒水平上可以及時(shí)方便的操作。研究表明，恒定鏈（in

2、variant chain，Ii）在抗原遞呈過程中起重要作用。Ii中與 CLIP 區(qū) N 端相連的四個(gè)氨基酸序列 LRMK 稱為 Ii-key， 具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用。Ii-key 已被作為免疫載體與抗原表位相連；Ii 的其他區(qū)域能促進(jìn)這種免疫增強(qiáng)作用。文章旨在以鼠 Ii 功能片段作為免疫載體，構(gòu)建含 NDV、IBDV 的4組不同串聯(lián)方式的多表位疫苗，研究多表位苗能否誘導(dǎo)產(chǎn)生針對不同病毒的抗體，及表位串聯(lián)順序的不同對免疫原性是否有影響

3、，以期獲得最佳的免疫原性。首先，選擇了 NDV 抗原表位 F306及 IBDV 抗原表位 VP2與鼠 Ii 的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、Ii-key 構(gòu)建串聯(lián)嵌合體：Cyt/TM/Ii-key/F306、Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、Cyt/TM/Ii-key/VP2、 Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306。 以實(shí)驗(yàn)室原有的質(zhì)粒 pEGFP-C1-Ii、pET-32a-F306、pET-32a-VP2為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)成功的

4、引物，將擴(kuò)增出來的目的片段插入原核表達(dá)載體 pET-32a 中。通過質(zhì)粒雙酶切鑒定及質(zhì)粒測序結(jié)果比對，表 明 構(gòu) 建 了 正 確 的 重 組 質(zhì) 粒 ： pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306 、pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/VP2、pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306， 同時(shí)以構(gòu)建的 pGEX-4T-1-F306、 pGE

5、X-4T-1-VP2作為檢測抗原。其次，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta 工程菌中，通過優(yōu)化融合蛋白的表達(dá)條件，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h，最佳誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L。用此最佳表達(dá)方法進(jìn)行蛋白的大量表達(dá)。經(jīng)改良 KCl 染色切膠法純化回收目的蛋白，最后獲得分子量約為41.35kDa、 43.22kDa、 31.56kDa、 43.22kDa、 37.22kDa、 27.43kDa的六組純化蛋白。采用 Folin-酚法檢測各

6、融合蛋白的濃度，六組蛋白濃度檢測結(jié)果 ： His-Cyt/TM/Ii-key/F306 為 1.47mg/mL 、 His-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2 為 0.91mg/mL、 His- Cyt/TM/Ii-key/VP2為0.78 mg/mL、 His-Cyt/TM/Ii-key/ VP2/ F306為0.96mg/mL、GST- F306為0.93 mg/mL、GST-VP2為0.85 mg/mL，均達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的