mChIL-18基因與IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTMDual中的共表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、白細(xì)胞介素18(Interleukine-18，IL-18)是一種多效細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的IFN-γ誘生能力，對機(jī)體起著重要的免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，在抗微生物感染、抗腫瘤免疫中具有應(yīng)用潛力，因此IL-18可作為免疫佐劑與一些病原微生物的保護(hù)性基因共表達(dá)，從而加強(qiáng)疫苗的免疫效果或制備基因工程疫苗;由于雞IL-18(ChIL-18)基因發(fā)現(xiàn)得比較晚，而對人和哺乳動(dòng)物IL-18的研究已有許多報(bào)道，且其具有與人和哺乳動(dòng)物相似的生物學(xué)功能，因此Ch

2、IL-18在比較免疫學(xué)研究和禽病治療中具有重要意義。pFastBacTM Dual載體含有PH啟動(dòng)子和p10啟動(dòng)子，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)具有獨(dú)立活性的外源蛋白。His標(biāo)簽的引入為重組蛋白的純化提供可能，為獲得大量有生物活性的蛋白開辟了新途徑。
　　 傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD病毒(IBDV)感染雛雞引起的以淋巴組織，特別是中樞免疫器官-法氏囊為主要特征的高度接觸性傳染病。該

3、病主要導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫能力降低和疫苗免疫接種失敗。雖然滅活疫苗和減毒活疫苗是相當(dāng)成熟的，但由于IBDV強(qiáng)毒株和抗原變異的出現(xiàn)使其免疫效價(jià)降低。VP2是IBDV的主要保護(hù)性抗原，已經(jīng)鑒定的IBDV中和表位主要在VP2上，并且多為構(gòu)象依賴性，這意味著VP2的立體結(jié)構(gòu)對其中和表位的形成至關(guān)重要，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)。
　　 禽流感(Avian influenza，AI)是由AI病

4、毒(AIV)感染引起的一種高度接觸性人畜共患傳染病。HPAI的暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)帶來了一定的經(jīng)濟(jì)損失，H5N1亞型AI的出現(xiàn)不僅產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)損失，還帶來了恐慌。AIV的主要抗原決定簇都位于HA1區(qū)域。體外表達(dá)HA1涵蓋了所有的HA空間中和表位，故其完全可以替代HA作為抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亞單位苗的理想候選抗原。
　　 本試驗(yàn)分別以pMD18-T-VP2，pMD18-T-HA1和 pMD18-T-mChIL18質(zhì)粒為模板，以桿

5、狀病毒pFastBacTM Dual為載體，將mChIL18基因與VP2基因或HA1基因分別插入到載體的PH啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pF-IL18，pF-VP2,pF-IL18-VP2，pF-HA1，pF-IL18-HA1。將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三重抗性(含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)與藍(lán)白斑篩選，用小量法提取重組桿狀病毒質(zhì)粒rBac-IL18，rBac-VP2，rBac-IL18-VP2，rBac

6、-HA1，rBac-IL18-HA1，通過一對通用引物M13 (Bacmid含有該引物Forward和 Reverse兩個(gè)引物位點(diǎn)，能夠從兩側(cè)擴(kuò)增LacZa互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的mini-attTn7位點(diǎn)，有利于PCR分析)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。在轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ的作用下，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將純化的rBac-IL18， rBac-VP2， rBac-IL18-VP2，rBac-HA1，rBac-IL18-HA1轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾細(xì)胞(Sp

7、odoptera frugiperda 9，sf9)獲得P1代重組桿狀病毒，用P1代病毒感染sf9來擴(kuò)增病毒滴度，將達(dá)到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重組桿狀病毒感染sf9，感染72h后收獲sf9細(xì)胞及培養(yǎng)上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測。SDS-PAGE檢測顯示，mChIL-18，VP2，HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表達(dá)，即表達(dá)的蛋白是可溶性的，表達(dá)的

8、目的條帶分子量分別約為19.5 KD,48.4 KD,37.4 KD。IFA檢測顯示mChILl 8基因與VP2基因或HA1基因分別同時(shí)在同一細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)。
　　 采用雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法)、IFN-γ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和水皰性口炎病毒(VSV)抑制試驗(yàn)對表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性測定。雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，不同濃度的pIL18，pVP2-IL18和pHA1-IL18均能夠明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，隨著蛋白濃度的增加刺激轉(zhuǎn)化作

9、用逐漸增強(qiáng)，均當(dāng)濃度為200ng/mL時(shí)，刺激轉(zhuǎn)化效果最佳，增殖指數(shù)可達(dá)4.13,4.35,4.09，但隨著蛋白濃度的增大淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)逐漸降低。VSV病毒活性抑制試驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)鞍诐舛却笥?00ng/mL時(shí)能刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并且‘隨著pIL18，pVP2-IL18和pHA1-IL18濃度的增加誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的量隨之增加;將不l司稀釋度的IFN-γ分別作用于VSV，在IFN-γ≥1 X102U/mL時(shí)，具有較強(qiáng)的抑制

10、效果，當(dāng)IFN-γ為10 U/mL時(shí)，只能達(dá)到約50％的保護(hù)。該結(jié)果說明pIL18，pVP2-IL18和pHA1-IL18的抗病毒活性是通過IFN-γ實(shí)現(xiàn)的，且在一定濃度范圍內(nèi)具有抑制VSV病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變的作用。 將含有pIL18，pVP2，pVP2-IL18的油乳劑疫苗分組免疫動(dòng)物，14d時(shí)一免,28d時(shí)二免Ⅰ組為傳統(tǒng)疫苗組;Ⅱ組為pIL18與B78減毒疫苗聯(lián)合疫苗組;Ⅲ為pIL18與pVP2聯(lián)合疫苗組;Ⅳ組為pVP2-IL18單獨(dú)

11、免疫組;Ⅴ組一免注射B78減毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ組為pVP2單獨(dú)免疫組;Ⅶ組為對照組。從體液免疫和細(xì)胞免疫水平上分析試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞免疫水平通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，與免疫前和陰性對照組相比，各試驗(yàn)組都促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖。一免后各試驗(yàn)組CD4+T細(xì)胞都呈上升趨勢，但一免后7d后又呈下降趨勢;二免后Ⅰ，Ⅲ,Ⅴ呈上升趨勢且持續(xù)時(shí)間比較長，其中Ⅳ組CD4+T增殖水平最高，在一免后2

12、1d,28d,35d都與其它組差異顯著(P<0.05)。一免后各試驗(yàn)組CD8+T細(xì)胞都呈上升趨勢，但一免后7d后又呈下降趨勢;二免后各實(shí)驗(yàn)組仍呈不同下降趨勢，其中Ⅰ組CD8+T增殖水平最高，在一免后14d,21d,28d都與其它組差異顯著((P<0.05)。體液免疫水平通過使用傳染性法氏囊病病毒抗體檢測試劑盒檢測，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，與免疫前相比，各試驗(yàn)組都有較好的促進(jìn)IBD抗體生成作用，抗體水平都持續(xù)增高且維持時(shí)間也

13、較長，都在在一免后28d抗體水平達(dá)到最高;與陰性對照組相比，Ⅳ組效果最好，抗體效價(jià)最高，Ⅴ組次之，然后是Ⅱ組、Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅵ組。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅵ組保護(hù)率可達(dá)90％，Ⅴ組次之可達(dá)80％，然后是Ⅰ組和Ⅱ組75％，Ⅲ組為70％，Ⅵ組50％，Ⅶ組無一幸免。
　　 將含有pIL18，pHA1，pHA1-IL18的油乳劑疫苗分組免疫動(dòng)物,7d時(shí)一免,21d時(shí)二免。Ⅰ組為傳統(tǒng)疫苗組;Ⅱ組為pIL18與傳統(tǒng)疫苗聯(lián)合疫苗組;Ⅲ為pHA1單獨(dú)免

14、疫組;Ⅳ組為pHA1-IL18單獨(dú)免疫組;Ⅴ組pIL18與pHA1聯(lián)合疫苗組;Ⅵ組為pHA1單獨(dú)免疫組;Ⅶ組為對照組。從體液免疫和細(xì)胞免疫水平上分析試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞免疫水平通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果表明，與免疫前和陰性對照組相比，各試驗(yàn)組都能夠明顯促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。一免后各試驗(yàn)組CD4+和CD8+T細(xì)胞都呈上升趨勢，但一免后7d后又呈下降趨勢;二免后雖呈上升趨勢且持續(xù)時(shí)間比較長，但增殖幅度不大，以IV組CD4+T增殖水