脊髓水平環(huán)氧合酶在切口痛大鼠術(shù)后痛覺超敏中的作用.pdf

1、本文采用大鼠切口痛模型，通過行為學(xué)、免疫組織化學(xué)和免疫印記沉淀的方法，觀察脊髓水平COX-1和COX-2及其活性產(chǎn)物PGE<,2>在術(shù)后痛覺超敏的形成和維持過程中的變化，同時，鞘內(nèi)分別給予選擇性COX-1抑制劑SC-560和COX-2抑制劑NS-398觀察其術(shù)后鎮(zhèn)痛作用。此外，通過不同時間點鞘內(nèi)注射COX-1抑制劑SC-560比較術(shù)后鎮(zhèn)痛效果，以探討其最佳給藥時機，從而為選擇性COX-1此外，有報道稱，急性傷害性刺激可以使脊髓背角神經(jīng)元

2、的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)發(fā)生磷酸化，因此通過觀察術(shù)后疼痛過程中脊髓背角p-ERK的表達變化，以及鞘內(nèi)給予選擇性COX-1抑制劑SC-560對大鼠脊髓中p-ERK表達的影響，以探討選擇性COX-1抑制劑術(shù)后鎮(zhèn)痛的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 論文一、術(shù)后疼痛大鼠脊髓水平環(huán)氧合酶和前列腺素E2的表達。 研究材料和方法： 1、實驗動物。選用雄性Wistar大鼠，體重220～260g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

3、 2、術(shù)后疼痛模型的制作。雄性Witar大鼠2％異氟醚麻醉后，采用Brerman的方法制作術(shù)后疼痛模型，即無菌消毒下在大鼠左后足掌中間距離足跟0.5cm處向腳趾方向縱行切開皮膚、筋膜，長約1.0cm，用眼科鑷提起跖肌，縱行切開，但未損傷其起止部位，輕壓止血后用5-0尼龍線縫合皮膚，局部給予抗生素軟膏預(yù)防感染。 3、動物分組。 行為學(xué)實驗(n=8)：分別在術(shù)前1天、術(shù)后2、4、6小時及1、2、3、5和7天分別測定大鼠術(shù)側(cè)和

4、對側(cè)后足機械縮足反射閾值(MWT)。免疫組化和WesternBlot實驗：48只大鼠根據(jù)取材時間點分為六組(n=8)，分別在術(shù)前、術(shù)后2、4、6、12和24小時取腰膨大脊髓，分別采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(n=4)和蛋白免疫印記(Western blot)(n=4)觀察大鼠脊髓中COX-1、COX-2蛋白表達變化情況。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗：20只大鼠根據(jù)取材時間點分為五組(n=4)，分別在術(shù)前、術(shù)后2、4、6和24小時各時間點取腰段

5、脊髓，觀察大鼠脊髓中PGE<,2>的含量變化。 4、統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準差表示，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5軟件處理，組內(nèi)比較用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(ANOvA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。 研究結(jié)果： 1、術(shù)后疼痛大鼠術(shù)前、術(shù)后縮足反射閾值(MWT)的變化所有動物雙側(cè)后足術(shù)前MWT基礎(chǔ)值無明顯差異。術(shù)后2h左(手術(shù)側(cè))后足MWT

6、即顯著下降，與術(shù)前和右(非手術(shù))側(cè)后足MWT比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，雖然此后MWT逐步升高，但是這種差異一直持續(xù)到術(shù)后3d(P<0.05)。非手術(shù)側(cè)各時間點MWT均無明顯變化。 2、術(shù)后疼痛大鼠脊髓水平COX-1和COX-2表達術(shù)前大鼠腰段脊髓中COX-1和COX-2均有少量表達，主要分布于脊髓背角淺層。與術(shù)前組相比，術(shù)后2h脊髓背角淺層COX-1的表達明顯增加，4h達到高峰(P<0.01),此后雖有所減少，但一直持

7、續(xù)到24h；術(shù)后2h脊髓背角COX-2表達雖有所增加，但明顯低于COX-1的表達，而且僅持續(xù)到術(shù)后6h，此后與術(shù)前組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。 3、術(shù)后疼痛大鼠腰段脊髓PGE<,2>含量的變化術(shù)后大鼠腰段脊髓中PGE<,2>含量迅速增高，術(shù)后2h至24h各時間點PGE<,2>含量均高于術(shù)前水平，4h達高峰，此后維持在較高的水平，術(shù)后24h PGE<,2>含量仍高于術(shù)前(P<0.05)。 論文二、鞘內(nèi)注射選擇性環(huán)氧合酶抑制劑對術(shù)后

8、疼痛大鼠痛覺超敏以及脊髓中前列腺素E<,2>的影響 研究材料和方法： 1、實驗動物同第一部分。 2、術(shù)后疼痛模型同第一部分。 3、鞘內(nèi)給藥。 Wistar大鼠2％異氟醚麻醉后，采用Mestre法單次鞘內(nèi)注射，即左手固定大鼠背部，右手持微量注射器于L<,5>-L<,6>椎間隙垂直于脊柱的方向穿刺，當(dāng)進入蛛網(wǎng)膜下腔時尾巴會突然出現(xiàn)側(cè)向甩動或輕微抖動。術(shù)后出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙或/和炎癥反應(yīng)的大鼠排除在實驗之

9、外。所有動物鞘內(nèi)給藥容積均為10μl，SC-560和NS-398分別溶于100％二甲基亞砜(DMSO)10μl。 4、動物分組： (1)行為學(xué)實驗一建立術(shù)后疼痛模型后，將術(shù)后2h出現(xiàn)痛覺超敏的大鼠40只隨機分為五組(n=8)：DMSO組，鞘內(nèi)注射DMSO10μl SC5組，鞘內(nèi)注射SC-560 5μg；SC50組，鞘內(nèi)注射SC-560 50μg:SC100組，鞘內(nèi)注射SC-560 100μg；NS組，鞘內(nèi)注射NS-398

10、 50μg。分別于給藥前、給藥后30min、1h、2h、4h、6h和24h測定大鼠MWT，并將SC各組給藥后30min的MWT轉(zhuǎn)換為最大效應(yīng)百分比(％MPE)。 (2)行為學(xué)實驗二48只大鼠隨機分為三大組(n=16)：BI組，A12組和A124組，分別術(shù)前15min、術(shù)后2h和24h鞘內(nèi)注射DMSO 10μl(n=8)或SC-5601001xg(n=8)。給藥后30min測定MWT，并將其轉(zhuǎn)換為鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比(％antiallo

11、dynia)． (3)ELISA實驗部分12只正常大鼠隨機分為三組(n=4)：DMSO組，術(shù)前15min鞘內(nèi)注射DMSO 10μl；SC組，術(shù)前15min鞘內(nèi)注射SC-560 100μg；NS組，術(shù)前15min鞘內(nèi)注射NS-398 50μg。分別于術(shù)后4h取大鼠腰段脊髓用ELISA技術(shù)檢測PGE<,2>的含量。 5、統(tǒng)計學(xué)處理同第一部分 研究結(jié)果： 1、術(shù)后鞘內(nèi)注射SC-560和NS-398對切口痛大鼠痛

12、覺超敏的影響以及不同時間點鞘內(nèi)注射SC-560鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比的觀察術(shù)前和給藥前各組的MWT沒有明顯差異，和給藥前以及DMSO組相比，SC50和SC100兩組給藥后MWT明顯升高(P<0.01)，SC50組給藥后MWT持續(xù)升高2h，而SCl00組的作用時間持續(xù)到給藥后6h(P<0.01)，隨著SC560鞘內(nèi)注射劑量的增加其％MPE也隨之增高，而SC5組、NS組與術(shù)前和DMSO組比較，在各個時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)前和術(shù)后2h鞘內(nèi)注射SC-

13、560鎮(zhèn)痛效應(yīng)％明顯高于術(shù)后24b給藥(P<0.01)。 2、SC-560和NS-398鞘內(nèi)注射對術(shù)后疼痛大鼠脊髓中PGE<,2>含量的影響和DMSO組相比，SC組明顯減少切口痛大鼠術(shù)后4h脊髓中PGE<,2>的含量(P<0.01)，NS組脊髓PGE<,2>的含量較DMSO組雖有所減少，但是無統(tǒng)計學(xué)差異。 論文三、選擇性環(huán)氧合酶-1抑制劑SC-560對術(shù)后疼痛大脊髓中ERK表達的影響。 研究材料和方法：

14、1、實驗動物同第一部分。 2、術(shù)后疼痛模型同第一部分。 3、鞘內(nèi)給藥同第一部分。 4、動物分組32只大鼠隨機分為四組(n=8)：對照組，正常大鼠；PP組，不給藥；SC組，術(shù)前15min鞘內(nèi)注射SC-560 100μg；DMSO組，術(shù)前15min鞘內(nèi)注射DMSO 10μl。各組分別于術(shù)后1h取大鼠腰段脊髓，用免疫組化(n=4)和Western blot技術(shù)(n=4)測定大鼠腰段脊髓p-ERK免疫陽性細胞數(shù)及p-ER

15、K蛋白的含量。 5、統(tǒng)計學(xué)處理同第一部分。 研究結(jié)果： 1、鞘內(nèi)注射SC-560對術(shù)后疼痛大鼠腰段脊髓p-EIK免疫陽性細胞的影響正常大鼠腰段脊髓背角僅有少量p-ERK免疫陽性細胞表達。術(shù)后1h患側(cè)腰段脊髓背角p-ERK免疫陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，主要集中分布在背角淺層(Ⅰ、Ⅱ?qū)?。和術(shù)后疼痛組比較，預(yù)先鞘內(nèi)注射SC-560 100μg術(shù)后1h脊髓背角p-ERK的陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，而

16、鞘內(nèi)注射DMSO不能減少p-ERK蛋白的表達(P>0.05)。 2、鞘內(nèi)注射SC-560對術(shù)后疼痛大鼠腰段脊髓p-ERK蛋白表達的影響術(shù)后1h大鼠腰段脊髓中p-ERK1/2蛋白的表達較正常大鼠均明顯增加(P<0.01)，與術(shù)后疼痛組相比，鞘內(nèi)注射SC-560可以抑制p-ERK1/2蛋白的表達(P<0.01)，而DMSO的作用不明顯。 研究結(jié)論： 1、脊髓水平的COX，主要是COX-1，和PGE<,2>參與切口痛大