L-單甲基-精氨酸對(duì)減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 目前，我國社會(huì)人口已經(jīng)出現(xiàn)老齡化趨勢，經(jīng)相關(guān)流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示退變性骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的發(fā)病率已呈逐年升高趨勢，預(yù)計(jì)在不久的將來，此疾病必將成為我國成年男性喪失勞動(dòng)能力的主要原因之一。以往的研究已顯示退變性骨關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)特征主要為關(guān)節(jié)部位的軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程呈明顯進(jìn)行性。一些研究還顯示，一氧化氮(NO)及其附屬產(chǎn)物的濃度表達(dá)水平與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡

2、數(shù)目，以及骨關(guān)節(jié)炎疾病的嚴(yán)重程度呈顯著的正相關(guān)性，在疾病的早期階段，NO及其附屬產(chǎn)物會(huì)刺激和誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，使關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)病理性降解。L-單甲基-精氨酸(L-NG-monomethyl-arginine，L-NMMA)是L-精氨酸的一種同類物，可與L-精氨酸競爭一氧化氮合成酶(Nitricoxidesynthase，NOS)的結(jié)合部位，對(duì)3種NOS均有抑制作用，選擇性不明顯，隨著作用時(shí)間延長，使誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)

3、不可逆地失活。鑒于L-單甲基-精氨酸對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制尚未完全闡明，本文擬選擇這一課題進(jìn)行研究，以闡明其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 選取30只實(shí)驗(yàn)性大白兔隨機(jī)分為正常組(A組)、模型組（B組）、L-NMMA低劑量治療組（C組）、L-NMMA中劑量治療組(D組)和L-NMMA高劑量治療組（E組），總共5個(gè)組，每組6只。采用HE染色法檢測各組的病理表現(xiàn)；檢測各組兔關(guān)節(jié)滑液中NO和血清NO的

4、表達(dá)水平；采用原位凋亡染色(TUNEL)和流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞的凋亡狀況；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunoadsordentassay，ELISA)法檢測各組兔血清骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforminggrowthfactor-β，TGFβ1)的表達(dá)水平；采用蛋白質(zhì)印跡(westem-bloting)法檢測各組軟骨組織半胱

5、天冬氨酸蛋白酶3(Caspases-3)的表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)方法檢測軟骨組織Bcl-2相關(guān)X蛋白(HumanBcl-2associatedXprotein，Bax)和重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2(B-CellLymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．正常組蘇木精咿紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色顯示：軟骨表層平整、光滑，細(xì)胞分布均勻，無簇聚軟骨細(xì)胞，潮線完

6、整；HE染色均勻，無失染現(xiàn)象；模型組HE染色顯示：表層變薄，有裂隙深至軟骨下骨；細(xì)胞排列紊亂，有大量簇聚軟骨細(xì)胞，潮線消失：HE染色不均勻，全層明顯失染；隨著L-單甲基-精氨酸治療濃度提高，軟骨組織結(jié)構(gòu)的破壞程度在組織學(xué)上呈現(xiàn)明顯緩解。模型組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分明顯高于正常組(P＜0.01)，且隨著L-單甲基-精氨酸治療濃度提高，兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分明顯下降(P＜0.05=。
　　 2．模型組兔關(guān)節(jié)液和血清NO的表達(dá)

7、水平明顯高于正常組（P＜0.01=，且隨著L-單甲基-精氨酸治療濃度的提高，關(guān)節(jié)液和血清NO的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05=。
　　 3．模型組兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率和凋亡指數(shù)明顯高于正常組（P＜0.01=，且隨著L-單甲基一精氨酸治療濃度的提高，凋亡率和凋亡指數(shù)明顯下降（P＜0.05=。
　　 4．模型組兔血清BMP2、TGFβ1的表達(dá)水平明顯低于正常組(P＜0.01=，且隨著L-單甲基-精氨酸治療濃度的提高，兔血清

8、BMP2、TGFβ1的表達(dá)水平明顯上升(P＜0.05)。
　　 5．模型組兔關(guān)節(jié)軟骨組織Caspases-3的表達(dá)水平明顯高于正常組(P＜0.01)，隨著L-單甲基精氨酸治療濃度提高，Caspases-3表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。
　　 6．模型組兔關(guān)節(jié)軟骨組織Bax的表達(dá)水平明顯高于正常組(P＜0.01)，隨著L-單甲基-精氨酸治療濃度提高，Bax的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)；模型組兔關(guān)節(jié)軟骨組織Bc1-

9、2的表達(dá)水平與正常組無明顯差異性(P＞0.05)，隨著L-單甲基-精氨酸治療濃度的提高，Bcl-2的表達(dá)水平明顯上升(P＜0.05)；隨著L-單甲基精氨酸治療濃度的提高，Bcl-2/Bax數(shù)值明顯上升(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 L-單甲基-精氨酸(L-NG-monomethyl-arginine，L-NMMA)可明顯降低關(guān)節(jié)液和血清NO及關(guān)節(jié)軟骨組織Caspases-3的表達(dá)水平，升高血清BMP2、TGFβ1