STAT5b靶控報(bào)告基因檢測(cè)IR激酶活性細(xì)胞模型的建立.pdf

1、目的：根據(jù)胰島素受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，構(gòu)建STAT5b應(yīng)答元件靶控報(bào)告基因的細(xì)胞模型，通過檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)水平間接監(jiān)測(cè)胰島素受體(IR)激酶活性，從而為高通量地篩選出以IR激酶為靶標(biāo)的藥物提供新的細(xì)胞模型。 方法：(1)轉(zhuǎn)染方案的選擇：通過對(duì)pEGFP-3與脂質(zhì)體不同的轉(zhuǎn)染比例，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞表達(dá)GFP效率比較，確定最佳的轉(zhuǎn)染方案。(2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立和驗(yàn)證：STAT5b靶控報(bào)告基因(聯(lián)合或不聯(lián)合IR基因及聯(lián)合或不聯(lián)合

2、STAT5b基因)對(duì)HepG2細(xì)胞或CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，檢測(cè)胰島素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞STAT5b靶控報(bào)告基因表達(dá)的影響，并比較分析聯(lián)合或不聯(lián)合IR基因及聯(lián)合或不聯(lián)合STAT5b基因?qū)?xì)胞模型靈敏性的影響，選擇最佳的細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型。(3)考察胰島素對(duì)細(xì)胞模型的量效和時(shí)效的關(guān)系。(4)通過IR激酶抑制劑考察細(xì)胞模型的特異性。(5)通過Z'因子考察細(xì)胞模型的穩(wěn)定性。(6)利用MTT法考察胰島素對(duì)細(xì)胞增殖功能的影響。 結(jié)果：(1)用pEGFP-C3

3、轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞來確定質(zhì)粒DNA與lipofectamineTM2000最佳轉(zhuǎn)染方案為質(zhì)粒DNA(μg)∶lipofectamineTM2000(μl)=1∶2。(2)HepG2細(xì)胞株與質(zhì)粒組合的考察，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染外源性的人胰島素受體pRC/CMV·hIR質(zhì)粒可以顯著提高細(xì)胞模型的靈敏度。(3)CHO細(xì)胞株與質(zhì)粒組合的考察，結(jié)果表明STAT5b蛋白在誘導(dǎo)Luc表達(dá)中發(fā)揮著重要作用的，本實(shí)驗(yàn)通過共轉(zhuǎn)染pBS-SK-STAT5b質(zhì)粒可以達(dá)

4、到此目的。分析比較兩種細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用pSTAT5b3-TK-LUC、pSV-β-Gal、pRC/CMV·hIR與pBS-SK-STAT5b四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞建立細(xì)胞模型。在10-7mol/L胰島素濃度下處理12小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)率為6.10倍達(dá)到最大值。通過胰島素對(duì)誘導(dǎo)Luc表達(dá)率的量效和時(shí)效的探討，發(fā)現(xiàn)胰島素對(duì)Luc誘導(dǎo)表達(dá)呈現(xiàn)出時(shí)效和量效的依賴性，并且胰島素作用濃度范圍較寬，實(shí)驗(yàn)靈敏度高，符合高通量篩選的要求。(4)模

5、型特異性的考察，通過受體酪氨酸激酶磷酸化抑制劑TyrphostinAG1024，在10μmol/L濃度下處理細(xì)胞時(shí)，即可使胰島素對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)率下降到陰性對(duì)照的84.53％；共轉(zhuǎn)染pMT2-wt1B質(zhì)粒表達(dá)的PTP1B蛋白可使受體酪氨酸激酶酪氨酸殘基保持去磷酸化狀態(tài)，使胰島素誘導(dǎo)表達(dá)率從6.10倍下降到1.24倍。(5)模型穩(wěn)定性的考察，Z'因子只與實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性與可靠性有關(guān)而與實(shí)驗(yàn)內(nèi)容無關(guān)，Z'因子在0.5～1時(shí)，模型穩(wěn)定性高。本

6、實(shí)驗(yàn)根據(jù)Z'因子的計(jì)算公式計(jì)算所得的Z'因子為0.61，說明所建立的細(xì)胞模型有良好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。(6)胰島素對(duì)CHO細(xì)胞增殖的影響考察，在10-13～10-4mol/L胰島素濃度下處理不同時(shí)間，采用MIT法在570nm處檢測(cè)A值，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所選用的10-7mol/L胰島素濃度處理12小時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無影響，不會(huì)影響模型的精確性與可靠性。 結(jié)論：通過對(duì)建立的STAT5b靶控報(bào)告基因檢測(cè)IR激酶活性細(xì)胞模型的各項(xiàng)性能的檢測(cè)結(jié)