p53基因多態(tài)性與病理性瘢痕的相關性研究及基因檢測試劑盒的構建.pdf

1、人的皮膚作為最大的器官擔負著保護人體內(nèi)部結構和各大臟器系統(tǒng)的重要功能，同時也在細胞代謝和生長增殖等生理過程發(fā)揮著調節(jié)作用。瘢痕是一種創(chuàng)傷愈合的結果，瘢痕在過度增生等情況下，引起機體不適或造成畸形及功能障礙時，被認為是病理現(xiàn)象，稱之為病理性瘢痕。病理性瘢痕是基因的表達發(fā)生變化，從而影響到堿基的轉換。瘢痕具有獨特的生長特性及臨床表現(xiàn)，其增殖-凋亡失衡時導致不斷增生而且難以退化的細胞學基礎。P53基因與其有密切的關系。瘢痕就細胞學而言是細胞過

2、度增生性病變，是指皮膚損傷后，成纖維細胞活性異常增高，結締組織過度增殖和透明變性而引起的。近年來國內(nèi)外許多學者在分子基因水平對病理性瘢痕形成某些機制進行了研究，不少學者認為成纖維細胞的p53基因的異常表達是病理性瘢痕形成的重要原因之一。
　　 臨床瘢痕主要分為增生性瘢痕和病理性瘢痕二種。由于增生性瘢痕與病理性瘢痕在臨床表現(xiàn)上相似，以往人們很易混淆兩種疾病的概念?，F(xiàn)在的研究已證實，增生性瘢痕的基本過程為機體自身過度修復的結果，多半

3、是局部性生長，病理性瘢痕臨床表現(xiàn)除了具有一般瘢痕的特性外，還有著“腫瘤樣生長”傾向、病變超出原損傷區(qū)、有特殊的高發(fā)部位、皮膚損傷可逐漸增大、病程長、無自行萎縮傾向、自覺瘙癢、刺痛和知覺減退、單純手術切除后極易復發(fā)等特點，病變不超出原損傷區(qū)，增生可以自限，但病程時間亦較長。
　　 病理性瘢痕的主要病理表現(xiàn)為成纖維細胞活性異常增多，結締組織不斷增殖和透明變性，瘢痕組織內(nèi)膠原及基質成分的大量沉積，精確的發(fā)病機制迄今未明。臨床上因外傷、

4、感染、手術、燒傷、燙傷或機械性刺激，或一些非常輕微的損傷（如穿耳、注射或暗瘡破潰）或無明顯的誘因，均可導致病理性瘢痕。病理性瘢痕形態(tài)可呈條狀、圓形、橢圓形或不規(guī)則形的堅硬扁平隆起，暗紅色、表面光滑發(fā)亮、無毛發(fā)。青壯年多發(fā)，好發(fā)于頭面部的耳垂、下頜，胸腹部的前胸、四肢的外側以及女性剖腹產(chǎn)傷口的恥骨聯(lián)合部等特殊部位。
　　 在暴露部位的病理性瘢痕影響美觀，造成容貌破損等，給患者帶來不適和痛苦，造成嚴重的心理負擔。病理性瘢痕是目前整形

5、外科的常見病，人們嘗試用不同的方法來治療，但遺憾的是，到目前為止無論是手術治療還是非手術治療，或者是聯(lián)合治療，仍然沒有一種完善的治療方案可以獲得穩(wěn)定又滿意的療效，給整形外科醫(yī)師帶來了工作上的困擾。
　　 病理性瘢痕難以治愈好的主要原因是該病發(fā)病機制還不十分明確。因此尋找病理性瘢痕的分子機理成為該領域的研究熱點。近年來，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），特別是p53基因第7

6、2位密碼子的多態(tài)性引起了人們的高度重視。如何預測和干擾病理性瘢痕的形成一直是整形外科的研究的熱點。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)瘢痕外周血淋巴細胞中p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型分布存在多態(tài)性，而且這種多態(tài)性分布在普通人群及病理性瘢痕人群中存在差異。這種分布的差異為臨床篩選瘢痕易感人群提供了理論依據(jù)。同時，為進一步推動研究的臨床應用，并進一步研制了p53基因檢測試劑盒。一種可以初步預測病理性瘢痕易感人群的檢測方法。
　　 基因

7、組序列的差異構成了不同個體與群體對疾病的易感性。人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性，最簡單的多態(tài)性形式是發(fā)生在基因組中的單個核苷酸的替代，單核苷酸多態(tài)性(SNP)指在二條同源染色體上，同源DNA序列長度相等，但個別核苷酸存在個體差異。單核苷酸多態(tài)性是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有一個

8、，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。由于SNP具有數(shù)量多、分布廣以及篩查快速等優(yōu)點，所以人們普遍認為SNP是新一代的遺傳標記。本研究擬在前課題組工作的基礎上，進一步明確p53基因的多態(tài)性與病理性瘢痕的關系，另一方面通過構建檢測p53基因的試劑盒，為篩查病理性瘢痕易感患者提供方便。
　　 實驗的目:
　　 1探討p53基因的多態(tài)性SNP位點與病理性瘢痕發(fā)病的可能關系，用熒光定量PCR方法，建立篩選人群病理性瘢痕的易感基因的

9、檢測標準。
　　 2研制可用于判斷瘢痕高危個體的基因檢測試劑盒。
　　 研究對象及方法:
　　 研究對象:一組為瘢痕組，收集臨床上已知的瘢痕患者105例。另一組為健康志愿者組，收集190例。取得知情權后抽取外周靜脈血樣本及登記相關臨床資料。
　　 實驗方法:抽取待測人群的外周靜脈血，提取全血中的DNA樣本;兩組均采用分子信標熒光PCR法檢測P53基因codon72多態(tài)性。設計一對p53基因第4外顯子的第7

10、2密碼子單核苷酸多態(tài)性(SNP)熒光分子信標探針，用Fam熒光分子標記CCC，用Hex熒光分子標記CGC，在定量熒光PCR(Real-time PCR)儀檢測該位點SNP，并與反向斑點雜交法，DNA直接測序等方法比較。根據(jù)已知p53基因72密碼子SNP基因型樣本的熒光定量測定結果，制定以下判別標準:以熒光強度≥本底熒光2.5倍為陽性反應。單純MBC探針（Fam綠色熒光）陽性判定為CCC/CCC純合子;單純MBG探針（HEX紅色熒光）陽性

11、判定為CGC/CGC純合子;MBC探針（Fam綠色熒光）和MBG探針(HEX紅色熒光)雙陽性判定為CCC/CGC雜合子。通過二種不同的熒光，顯色不同結果判定待檢者p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型，通過比較，判斷這種方法的優(yōu)勢。
　　 實驗結果:
　　 本組實驗共檢測了臨床瘢痕組105例及健康組190例的血樣本中的p53基因codon72基因表達。瘢痕組中p53基因外顯子4第72位密碼子顯示基因型為C/C型為78人

12、，占總數(shù)的74.29％;顯示基因型為C/G型為18人，占總數(shù)的17.14％;顯示基因型為G/G型為9人，占總數(shù)的8.57％，與DNA測序結果相同。
　　 統(tǒng)計健康組的基因型分布情況為:健康組中p53基因codon72顯示基因型為脯氨酸(C)/脯氨酸(C)型為43人，占總數(shù)的22.05％;顯示基因型為脯氨酸(C)/精氨酸(G)型為70人，占總數(shù)的35.90％;顯示基因型為精氨酸(G)/精氨酸(G)型為77人，占總數(shù)的39.69％。

13、統(tǒng)計學分析，實驗結果表示:臨床上應用分子信標熒光PCR法對p53基因codon72多態(tài)性的檢測，基因型為C/C與基因型為C/G+G/G術后發(fā)生病理性瘢痕的風險差異有統(tǒng)計學意義，且高于基因型為C/G+G/G的患者(P＜0.01)。C/C純合子與其他基因型相比較，與病理性瘢痕有較高的相關性，存在病理性瘢痕患病風險。
　　 實驗結論:
　　 成功地建立了簡單、快速和精確地分析瘢痕體質相關易感基因單核苷酸多態(tài)性的方法;這些易感基

14、因單核苷酸多態(tài)性可能與病理性瘢痕發(fā)病相關。熒光探針標記法創(chuàng)新了檢測p53基因的方法，準確率高，更方便快捷，可以作為預測病理性瘢痕易感人群的檢測手段對判斷病理性瘢痕高危個體具有指導意義。
　　 臨床意義:
　　 推廣和應用，為臨床預測病理性瘢痕易感人群提供一種可能。試劑盒的成功研制對病理性瘢痕易感人群的篩查，有臨床指導意義。為需要手術的患者預測病理性瘢痕的患病風險，提前做好瘢痕的預防性治療，減少了心理負擔。盡量減少病理性瘢

15、痕發(fā)生的可能性。一旦檢測出陽性結果，對于未發(fā)病的瘢痕易感者可以給予盡早的警示，盡量避免穿耳、擠破暗瘡等不必要的損傷，降低患病風險，及時給予患者避免瘢痕增生的警示和增強易感者自我防治的意識。PCR熒光分子信標檢測技術優(yōu)于PCR-反向斑點雜交法，更適合臨床應用，給患者帶來了福音，給瘢痕體質的人們開啟了另一扇窗戶。檢測p53基因codon72多態(tài)性SNP位點的試劑盒新方法具有檢測準確、迅速、使用方便、成本不高等優(yōu)點，臨床上可以考慮作為檢測病理