p53基因codon72多態(tài)性與剖腹產(chǎn)術(shù)后瘢痕增生的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　 皮膚作為人體面積最大的器官擔負著保護人體內(nèi)部結(jié)構(gòu)和各大臟器系統(tǒng)的重要功能。一旦受到損傷,皮膚就會迅速的產(chǎn)生各種應(yīng)激性反應(yīng),最終達到瘢痕愈合。瘢痕是人體創(chuàng)傷后自身修復(fù)的必然產(chǎn)物,沒有瘢痕形成就沒有愈合,瘢痕是臨床愈合的標志。瘢痕只有在過度增生等情況下,引起機體不適或造成畸形及功能障礙時,才被認為是病理現(xiàn)象。引起病理現(xiàn)象的瘢痕稱之為病理性瘢痕,是在創(chuàng)傷愈合過程中,受局部微環(huán)境的影響,基因的表達發(fā)生變化,從而影響到瘢

2、痕的轉(zhuǎn)歸。臨床多見的有增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩。由于增生性瘢痕與瘢痕疙瘩在臨床表現(xiàn)上極其相似,人們很易混淆兩種疾病的概念。以往研究已證實,瘢痕疙瘩除了具有一般病理性瘢痕的特性外,還有著“腫瘤樣生長”傾向、病變超出原損傷區(qū)、有特殊的高發(fā)部位、手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)等特點。而增生性瘢痕多半是局部性生長,病變不超出原損傷區(qū)。其發(fā)生均為機體自身過度修復(fù)的結(jié)果。
　　 病理性瘢痕的主要病理表現(xiàn)為瘢痕組織內(nèi)膠原及基質(zhì)成分的大量沉積。其發(fā)病機制迄今未

3、明,臨床上瘢痕疙瘩的發(fā)病可以是因為一些非常輕微的損傷(如穿耳、注射或暗瘡破潰)或是無明顯的誘因,表現(xiàn)為病程長,多持續(xù)增長,無自行萎縮傾向。青壯年多發(fā),好發(fā)于耳垂、前胸、上頸區(qū)、肩以及女性剖腹產(chǎn)傷口的恥骨聯(lián)合部等特殊部位。其病程長,不斷擴增,有時伴有痛癢癥狀的表現(xiàn)；而增生性瘢痕,不超出病損區(qū),增生可以自限,但病程時間亦較長。在暴露部位的病理性瘢痕影響美觀,造成容貌損害等等,均給患者造成嚴重的心理負擔。病理性瘢痕是目前整形外科的常見病,治療

4、方法有限,尤其是瘢痕疙瘩,人們嘗試用不同的方法來治療瘢痕疙瘩,但遺憾的是,到目前為止無論是手術(shù)治療還是非手術(shù)治療,或者是聯(lián)合治療,仍然沒有一種完善的治療方案可以獲得穩(wěn)定又滿意的療效。雖然病理性瘢痕是一種良性疾患,但是它的病理特點和臨床特征給患者帶來了生理和心理上的痛苦。臨床上缺乏滿意的治療手段,也給整形外科醫(yī)師帶來了工作上的困擾。
　　 如何預(yù)測和干擾瘢痕疙瘩的形成一直是本領(lǐng)域研究的熱點。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩外周血淋巴

5、細胞中p53基因外顯子4第72位密碼予的基因型分布存在多態(tài)性,而且這種多態(tài)性分布在普通人群及瘢痕疙瘩人群中存在差異。這種分布的差異為臨床篩選瘢痕疙瘩易感人群提供了理論及實驗依據(jù)。同時,為進一步推動研究的臨床應(yīng)用,前課題組在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,成功研制了p53基因檢測試劑盒。該試劑盒是應(yīng)用ASO(等位基因特異性寡核苷酸探針法)及PCR-反向斑點雜交技術(shù)來對p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型進行鑒別。
　　 前課題組應(yīng)用該試劑盒

6、通過提取DNA樣本；設(shè)計擴增p53基因外顯子4片段的引物,多聚酶鏈反應(yīng)對DNA樣本進行擴增；設(shè)計與外顯子4第72位密碼子兩種不同等位基因相吻合的探針,制備顯色膜條,應(yīng)用反向斑點雜交技術(shù),通過三種不同的顯色結(jié)果判定待檢者p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型。最后統(tǒng)計分析三種基因型的分布差異,得出結(jié)論:人類p53基因外顯子4中72位密碼子C等位基因及CC基因型可能是中國廣東地區(qū)漢族人群瘢痕疙瘩的易感因素,瘢痕疙瘩p53基因檢測試劑盒是一

7、種可以初步預(yù)測瘢痕疙瘩易感人群的檢測手段。
　　 有文獻報道,亞洲黃色人種瘢痕疙瘩臨床發(fā)病率在2.3‰,而增生性瘢痕的發(fā)生率明顯高于瘢痕疙瘩,雖然無向正常皮膚浸潤、持續(xù)增生的病理特征,但臨床表現(xiàn)極為相似,同樣困擾患者,影響他們的日常生活。在p53基因異常表達方面的研究,有學(xué)者報道,增生性瘢痕與瘢痕疙瘩之間無顯著性差異；在p53基因多態(tài)性的研究中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CCC/CCC基因型者增生性瘢痕的發(fā)生率提高。于是我們考慮在檢測p53基因c

8、odon72多態(tài)性篩查易感人群時,將增生性瘢痕納入其中,統(tǒng)稱為病理性瘢痕的易感人群的篩查。目前臨床上尚無預(yù)測病理性瘢痕易感人群的檢測手段,本課題旨在通過研究p53 codon72多態(tài)性與病理性瘢痕的相關(guān)性,用更準確快速的方法檢測易感人群,為臨床患者做好預(yù)防性治療奠定基礎(chǔ)。
　　 實驗?zāi)康?
　　 1.建立熒光分子信標PCR檢測P53基因SNP的方法(熒光探針標記法),提高準確率,簡化操作,降低成本,縮短時間,使之更易于臨

9、床推廣。
　　 2.應(yīng)用熒光分子信標PCR法對剖腹產(chǎn)女性進行大樣本量p53基因codon72多態(tài)性的臨床篩查,并對受測者進行臨床隨訪,觀察臨床患者瘢痕轉(zhuǎn)歸與基因型的相符性。為臨床預(yù)測病理性瘢痕的發(fā)病風(fēng)險提供依據(jù)。
　　 研究對象及方法:
　　 研究對象:一組為瘢痕疙瘩組,收集臨床上已知的瘢痕疙瘩患者28例。另一組為剖腹產(chǎn)術(shù)后組,收集260例剖腹產(chǎn)術(shù)后女性(剛做完剖腹產(chǎn)一周內(nèi)的產(chǎn)婦)的外周靜脈血樣本及相關(guān)臨床資料。

10、選擇剖腹產(chǎn)女性,手術(shù)部位較恒定。兩組排除了病理性瘢痕及腫瘤史。實驗方法:抽取待測人群的外周靜脈血,提取全血中的DNA樣本；兩組均采用分子信標熒光PCR法檢測P53基因codon72多態(tài)性.瘢痕疙瘩組設(shè)計一對p53基因第4外顯子的第72密碼子單核苷酸多態(tài)性(SNP)熒光分子信標探針,用Fam熒光分子標記CCC,用hex熒光分子標記CGC,在定量熒光PCR(Real—time PCR)儀檢測該位點SNP,并與反向斑點雜交法,DNA直接測序等

11、方法比較。根據(jù)已知p53基因72密碼子SNP基因型樣本的熒光定量測定結(jié)果,制定以下判別標準:以熒光強度≥空白管熒光強度2.0倍為陽性反應(yīng)。單純MBC探針(Fam綠色熒光)陽性判定為CCC/CCC純合子；單純MBG探針(HEX紅色熒光)陽性判定為CGC/CGC純合子；MBC探針(Fam綠色熒光)和MBG探針(HEX紅色熒光)雙陽性判定為CCC/CGC雜合子。通過三種不同的熒光顯色結(jié)果判定待檢者p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型,通過

12、比較,判斷這種方法的優(yōu)勢。剖腹產(chǎn)術(shù)后組用分子信標熒光PCR法檢測p53基因codon72多態(tài)性,并統(tǒng)計分析三種基因型的分布差異,結(jié)合臨床隨訪結(jié)果,觀察基因型與臨床病理性瘢痕的患病關(guān)系。
　　 實驗結(jié)果：
　　 本組實驗共檢測了臨床瘢痕疙瘩組28例及剖腹產(chǎn)術(shù)后組260例的血樣本中的p53基因codon72基因表達。瘢痕疙瘩組中p53基因外顯子4第72位密碼子顯示基因型為C/C型為12人,占總數(shù)的42.87％；顯示基因型為C

13、/G型為10人,占總數(shù)的35.71％；顯示基因型為G/G型為6人,占總數(shù)的21.43％。與DNA測序結(jié)果相同；再用反向斑點雜交法測試,顯示三種基因型分別為C/C14例、C/G9例、G/G6例,與DNA測序結(jié)果吻合率為92.86％。分子信標熒光PCR法檢測結(jié)果與DNA測序結(jié)果吻合,準確率為100％,高于反向斑點雜交法的為92.86％。分子信標法的靈敏度為42.86％,特異性為87.5％；反向斑點法的靈敏度為50％,特異性為83.34％。分

14、子信標法的靈敏度低于反向斑點雜交法,但特異性高于反向斑點雜交法。
　　 統(tǒng)計剖腹產(chǎn)術(shù)后組與術(shù)后瘢痕增生組的基因型分布情況為:剖腹產(chǎn)術(shù)后組中p53基因codon72顯示基因型為脯氨酸(C)/脯氨酸(C)型為46人,占總數(shù)的19.3％；顯示基因型為脯氨酸(C)/精氨酸(G)型為117人,占總數(shù)的49.2％；顯示基因型為精氨酸(G)/精氨酸(G)型為75人,占總數(shù)的31.5％。臨床隨訪260例女性,發(fā)生瘢痕增生的22例,其對應(yīng)的基因型

15、分別是C/C型9例,占患病人數(shù)的40.996,C/G型8例,占患病人數(shù)的36.36％,G/G型5例,占患病人數(shù)的22.72％。行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗結(jié)果示:臨床上應(yīng)用分子信標熒光PCR法對手術(shù)創(chuàng)傷后女性做p53基因codon72多態(tài)性的檢測,基因型為C/C的產(chǎn)婦與基因型為C/G+G/G術(shù)后發(fā)生病理性瘢痕的風(fēng)險差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且高于基因型為C/G+G/G的產(chǎn)婦(P<0.05)。C/C純合子與其他基因型相比較,與病理性瘢痕有較高的相關(guān)性,存在

16、病理性瘢痕患病風(fēng)險。
　　 實驗結(jié)論：
　　 人類p53基因第72位密碼子多態(tài)性位點的基因型檢測對發(fā)現(xiàn)病理性瘢痕的易感人群有臨床指導(dǎo)意義；熒光探針標記法更新了瘢痕疙瘩p53基因檢測試劑盒的方法,準確率高,更方便快捷,可以作為預(yù)測病理性瘢痕易感人群的檢測手段,為臨床上預(yù)測病理性瘢痕的發(fā)病風(fēng)險提供一種新方法。
　　 臨床意義：
　　 推廣和應(yīng)用,為臨床預(yù)測病理性瘢痕易感人群提供一種可能。對手術(shù)后女性前瞻性研究

17、表明對病理性瘢痕易感人群的篩查,有臨床指導(dǎo)意義。為需要手術(shù)的患者預(yù)測病理性瘢痕的患病風(fēng)險,提前做好瘢痕的預(yù)防性治療,盡量減少病理性瘢痕發(fā)生的可能性。一旦檢測出陽性結(jié)果,對于未發(fā)病的瘢痕疙瘩易感者可以給予盡早的警示,盡量避免穿耳、擠破暗瘡等不必要的損傷,降低患病風(fēng)險,及時給予臨床工作者避免瘢痕增生的警示和增強易感者自我防治的意識。PCR熒光分子信標檢測技術(shù)優(yōu)于PCR-反向斑點雜交法,更適合臨床p53基因codon72 SNP快速診斷。瘢痕