人骨肉瘤9901細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、目的:①構(gòu)建人骨肉瘤細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫;②采用骨肉瘤患者的混合血清對9901細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫篩選,以得到可引起免疫應(yīng)答的白血病腫瘤相關(guān)抗原;③通過生物信息學(xué)分析,比較篩選得到的陽性克隆,獲取具有應(yīng)用價值的獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的新基因,為該課題的進(jìn)一步研究確定方向.方法:①提取9901細(xì)胞總RNA,分離mRNA,反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,消平cDNA末端,連接EcoR Ⅰ適配子,磷酸化EcoR Ⅰ適配子5'端;Sephacryl-S4

2、00柱除去小于400bp cDNA片段,與噬菌體λgt11(載體)連接,用包裝蛋白體外包裝后建成初級cDNA文庫;取適量包裝體系倍比稀釋后感染E. coli Y1090,測定文庫大小及重組率;隨機(jī)挑取10個噬斑,在ExAssist輔助性噬菌體的作用下,釋放出PBK-CMV噬菌粒;感染大腸桿菌XLOLR,鋪于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震搖過夜;提取質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ和Xho Ⅰ酶切后,初步確定片段的大小及多樣性.②感染有重組

3、λgt11噬菌體的大腸桿菌XL1-Blue MRF'鋪于150mm NZY平板,37℃倒置培養(yǎng)6h后,將IPTG預(yù)先處理的硝酸纖維素膜覆蓋于平板上,繼續(xù)培養(yǎng)10h,做好標(biāo)記;取下硝酸纖維素膜,用封閉液室溫封閉1h后,置于1:100稀釋的骨肉瘤患者血清(預(yù)先用大腸桿菌裂解物吸收)中孵育15h,再置于1:2500稀釋的生物素化二抗中孵育1 h,然后與1:2500稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的親合素孵育1h;采用NBT/BCIP對陽性噬斑顯色;挑取陽

4、性噬菌斑,再經(jīng)3輪復(fù)篩,直至得到一致的陽性噬斑.③獲得的陽性噬菌體克隆,在ExAssist輔助性噬菌體的作用下,在大腸桿菌XL1-Blue MRF'中剪切后,轉(zhuǎn)變?yōu)镻BK-CMV噬菌粒,感染大腸桿菌XLOLR后,鋪于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震搖過夜;抽提質(zhì)粒,經(jīng)EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后,初步確定片段的大小,然后測序.④采用BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析;采用Grail、ProtParam、ScanProsite、