致腎盂腎炎大腸桿菌新基因R049的鑒定和特性的研究.pdf

1、目的: 從國(guó)內(nèi)臨床分離的致腎盂腎炎大腸桿菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）132中發(fā)現(xiàn)與致病性相關(guān)的新基因，并初步了解其特性，為進(jìn)一步研究UPEC致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 1．采用PCR方法對(duì)UPEC132特異性編碼序列R049片段（789bp）在UPEC菌株和正常人糞便分離大腸桿菌菌株中的分布進(jìn)行分析。R049片段陽(yáng)性的菌株經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Southern雜

2、交，確認(rèn)R049片段在受試菌株染色體的分布特征。 2．采用基因組步移技術(shù)，以R049片段（789bp）為核心雙向延伸，獲得其5’端和3’端側(cè)翼序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析尋找可能的開(kāi)放閱讀框R049-ORF，并提交GenBank注冊(cè)。 3．構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)E．coli BL21（DE3）/pET32a-R049，SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況，鎳親和層析純化后的R049重組蛋白免疫小鼠獲得抗血清，ELISA測(cè)定血清效價(jià)。

3、以此抗血清對(duì)UPEC132全菌裂解物以及提取的UPEC132內(nèi)膜與外膜蛋白進(jìn)行Western blot分析。 4．觀察UPEC132對(duì)人膀胱移行上皮細(xì)胞（EJ）的黏附，并且用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白標(biāo)記的UPEC132是否能夠侵入EJ細(xì)胞內(nèi)部。采用22KHuman Genome Array基因芯片檢測(cè)UPEC132感染的EJ細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，分析感染過(guò)程中涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。相比之下，構(gòu)建R049-ORF真核表達(dá)質(zhì)粒

4、，將其轉(zhuǎn)染EJ細(xì)胞，檢測(cè)基因表達(dá)譜的變化，分析差異表達(dá)基因的功能。 5．以大腸桿菌無(wú)菌毛株K-12 p678-54構(gòu)建表達(dá)R049-ORF的重組菌E．coliK-12 p678-54/pACYC184-R049，該重組菌與E．coli K-12 p678-54分別經(jīng)尿道逆行感染BALB/c小鼠，通過(guò)小鼠尿液與腎組織細(xì)菌計(jì)數(shù)和腎臟病理學(xué)檢查觀察兩種菌株對(duì)動(dòng)物致病性的差異。同時(shí)以R04q重組蛋白免疫BALB/c小鼠，對(duì)免疫組小鼠和未

5、免疫組小鼠經(jīng)尿道逆行感染UPEC132，通過(guò)上述檢測(cè)分析R049-ORF編碼蛋白對(duì)同源性菌株攻擊的免疫保護(hù)作用。 結(jié)果: 1．R049片段（789bp）在20株UPEC和40株正常人糞便分離的大腸桿菌中陽(yáng)性率分別為40%（8/20株）和7．5%（3/40株），兩者有顯著性差異（P<0．01）。11株R049片段陽(yáng)性的菌株經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳和Southern blot分析，其中有6株UPEC陽(yáng)性雜交帶均為350kb，與國(guó)外模

6、型菌株UPEC J96陽(yáng)性雜交帶不同，提示R049片段在國(guó)內(nèi)UPEC中具有共同聚集性分布的特征。 2．對(duì)R049片段（789bp）雙向延伸，獲得其5’端1502bp和3’端1207bp，經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得一個(gè)可能的R049-ORF（1311bp），經(jīng)BLAST搜索未發(fā)現(xiàn)與之相似序列，GenBank注冊(cè)號(hào)為EF488001。 3．R049重組蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白26．2%，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，鎳親和層析純化后其純

7、度大于95%。純化的R049重組蛋白制備的抗血清，效價(jià)達(dá)1：102400以上。經(jīng)Western blot檢測(cè)，該抗血清與UPEC132全菌裂解物和UPEC132的外膜蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，陽(yáng)性條帶與R049-ORF編碼蛋白預(yù)測(cè)分子量（47 KD）相一致，表明R049-ORF系編碼UPEC132外膜蛋白的基因。 4．UPEC132對(duì)EJ細(xì)胞黏附率為（73．20±5．26）%，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌能夠侵入EJ細(xì)胞內(nèi)。UPEC132

8、感染的EJ細(xì)胞有29個(gè)差異表達(dá)基因（1個(gè)下調(diào)，28個(gè)上調(diào)），主要涉及細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，分屬M(fèi)APK信號(hào)途徑、Toll樣受體信號(hào)途徑和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的TNF受體途徑。R049-ORF轉(zhuǎn)染的EJ細(xì)胞IL-6基因上調(diào)大于2倍，與炎癥反應(yīng)有關(guān)。 5．分別以重組菌E．coli K-12 p678-54/pACYC184-R049與E．coli K-12 p678-54感染小鼠，尿液與腎組織細(xì)菌計(jì)數(shù)和腎臟病理學(xué)改變無(wú)明顯差異

9、。R049重組蛋白免疫小鼠的血清抗體效價(jià)為1：25600-1：51200，免疫組小鼠尿液和腎組織細(xì)菌計(jì)數(shù)均顯著小于未免疫組（P<0．01，P<0．05），但兩組各有部分小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，無(wú)明顯差異。提示R049基因未表現(xiàn)出致病性，但R049基因編碼蛋白對(duì)同源性菌株的攻擊具有一定的免疫保護(hù)作用。 結(jié)論: 1．UPEC132新基因R049特異性地與UPEC菌株相關(guān)。 2．R049-ORF（1311bp）編碼U