柑橘衰退病毒的進(jìn)化與起源初步分析.pdf

1、柑橘衰退病(Tristeza)是由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的一種具有經(jīng)濟(jì)重要性的病害，廣泛分布于世界各柑橘產(chǎn)區(qū)，對(duì)全世界的柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。CTV屬于長(zhǎng)線形病毒屬(Closterovirus)，病毒粒子呈11×2,000nm的長(zhǎng)線形，基因組約19,300個(gè)核苷酸組成的止義單鏈RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因組中最人的病毒，具有12個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)，可以編碼19種以

2、上的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在5’端和3’端各有107nt和1275nt的非翻譯區(qū) (URT)。CTV存在復(fù)雜的株系分化現(xiàn)象，不同的CTV分離株能引起包括莖陷點(diǎn)、酸橙作砧木的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在內(nèi)的多種癥狀。隨著品種結(jié)構(gòu)調(diào)整，莖陷點(diǎn)型柑橘衰退病為害日益加重。由于CTV在田間通過(guò)蚜蟲傳播，對(duì)其最有效的防治方法是應(yīng)用弱毒株系交叉保護(hù)技術(shù)(MSCP)，而對(duì)其株系研究是應(yīng)用該技術(shù)的基礎(chǔ)。 本研究從我國(guó)野生柑橘資源豐富的地區(qū)收集CTV分離株，經(jīng)

3、直接組織點(diǎn)免疫(DTBIA)和反轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)，陽(yáng)性樣品嫁接保存于網(wǎng)室錦橙實(shí)生苗上。應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增CTV分離株的主要衣殼蛋白基因(p25基因)，結(jié)合限制性內(nèi)切酶Hinf I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，同時(shí)對(duì)CTV分離株的p25基因進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，初步明確我國(guó)野生柑橘資源感染CTV及其分離株組群構(gòu)成情況。同時(shí)，通過(guò)對(duì)野生柑橘上的CTV分離株及國(guó)內(nèi)栽培甜橙及柚上的

4、強(qiáng)弱毒CTV代表分離株的部分基因片段(p23、p20、p13、p18、p25、p27、POL、HEL、k17)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，并同國(guó)外典型CTV分離株相應(yīng)基因片段進(jìn)行序列比對(duì)，繪制基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)狀分類圖進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，初步明確野生柑橘上的CTV分離株同國(guó)內(nèi)外栽培品種上CTV分離株間的序列差異程度，為弱毒株保護(hù)技術(shù)的應(yīng)用和衰退病毒的進(jìn)化及起源分析提供相關(guān)依據(jù)。 主要研究結(jié)果： 1 野生柑橘品種的收集和CTV檢測(cè)分別從我

5、國(guó)云南、四川、重慶、廣西、湖南、江西等野生柑橘主要分布地區(qū)收集到79個(gè)野生柑橘樣品，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)(重慶)柑橘圃鑒定后進(jìn)行DTBIA和RT-PCR檢測(cè)，篩選出共有11個(gè)野生柑橘樣品攜帶CTV，帶毒率為13.9％，說(shuō)明野生柑橘存在CTV的感染。 2野生CTV分離株的組群構(gòu)成分析2.1 RFLP分析對(duì)野生柑橘上的11個(gè)CTV分離株p25基因經(jīng)RFLP分析，有72.7％的樣品出現(xiàn)單-p25/Hinf I RFL

6、P譜型，其中以第3組群為主，第1組群次之；有27.3％的樣品表現(xiàn)出p25/Hinf I RFLP第1、3組群和第2、3組群混合譜型。 有一個(gè)樣品含有p25/Hinf I RFLP第4組群，可能是具有潛在保護(hù)作用的弱毒株；另外一個(gè)樣品為第6組群。 2．2 SSCP分析通過(guò)對(duì)野生柑橘上的11個(gè)CTVp25基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明RFLP分析為混合組群的3個(gè)CTV分離株具有4條特征性譜帶外，其余分離株均只有兩條

7、特征性譜帶，說(shuō)明在野生狀態(tài)下生存的柑橘植株主要受CTV株系的單一組群為害，并且SSCP分析與RFLP分析的結(jié)果相一致。 3進(jìn)化起源分析將野生柑橘上的11個(gè)CIV分離株和國(guó)內(nèi)栽培甜橙和柚上的強(qiáng)弱毒代表分離株位于基因組3’端的p23、p20、p13、p18、p25、p27和位于中部的RdRp和p33基因的交疊部分POL片段以及5’的HEL、k17基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。 3．1 同源性分析將上述9個(gè)基因片段的序列進(jìn)行同源性比

8、對(duì)分析，結(jié)果表明11個(gè)野生CTV基因組的3’端的序列同源性較高，保守性較強(qiáng)，5’端的序列變異較大。在分析的9個(gè)基因片段中位于3’端的rp25基岡的保守性最高，野生柑橘上11個(gè)CTV分離株間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為92.1％～99.5％和94.8％～100％，同國(guó)內(nèi)栽培品種上的4個(gè)代表分離株以及國(guó)外栽培品種上的21個(gè)代表株之間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為91.3％～99.5％和95.2％～100％，91.3％～99.6％和

9、194.3％～100％；11個(gè)野生CTV分離株位于基因組5’端的HEL基因片段的核苷酸和氨基酸序列同源性最低為77.0％和86.3％，k17基因片段的核苷酸和氨基酸序列同源性最低只有65.5％和63.2％。 3．2遺傳進(jìn)化分析9個(gè)基因片段序列的遺傳進(jìn)化分析表明，堿基含量15C

10、苷酸序列中堿基A的含量最高，C的含量最低；p20、p13、p18、POL、HEL、k17基因片段核苷酸序列中堿基T的含量最高，C的含量最低。低GC含量說(shuō)明序列的突變率較低。 其中p25基因片段核苷酸序列中變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)的25.2％，氨基酸序列中變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)的17.5％；k17基因片段的變異最大，核苷酸序列中變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)的50.7％，氨基酸序列中變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)的55.1％；從野生柑橘樣品和國(guó)內(nèi)外栽培品種上的CTV分離株

11、密碼子第一、二、三位的堿基替換的情況看，總的來(lái)說(shuō)，具有編碼序列的共同特點(diǎn)：密碼子第三位的堿基替換數(shù)最多，其次為第一位，最少是第二位，轉(zhuǎn)換數(shù)多于顛換數(shù)，比率在2以上；p25、p27、p23、p20、p13、p18、POL、k17基因片段序列間的同義突變(d<,S>)和非同義突變(d<,N>)比較表明：序列間總的比較d<,S>大于d<,N>，而且差異顯著(P<0.05)，只有在含有國(guó)外栽培品種上的CTV分離株的分析組群的．HEL基因片段比對(duì)

12、序列中非同義突變與同義突變相比，無(wú)明顯的差異(P>0.05)。 CTV分離株間p25基因遺傳距離最小，5’端的遺傳距離逐漸增大。同源性較高的序列間的遺傳距離較小，同源性較低的分離株間遺傳距離較人。 從分析的位于CTV整個(gè)基因組不同位置的9個(gè)基因片段的同源性及遺傳變異的情況來(lái)說(shuō)，在基因組的3’端同源性較高，遺傳變異較小，從3’端到5’端同源性逐漸降低，遺傳變異逐漸增大。d<,N>均顯著低于d<,s>(d<,N>/d<,S>

13、<1)，低d<,N>值表明分析的CTV 9個(gè)基因片段在進(jìn)化過(guò)程中承受著凈化選擇，說(shuō)明它們對(duì)CTV來(lái)說(shuō)是重要的。 3．3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建以BYV或LIYV的相應(yīng)基因核苷酸序列為外群對(duì)分析的CTV分離株9個(gè)基因片段核苷酸序列構(gòu)建MP樹(shù)、NJ樹(shù)，每個(gè)基因片段核苷酸序列構(gòu)建的MP、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)除個(gè)別支系間的聚合關(guān)系有所不同外，兩種系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本是相似的。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中，聚類在同一支上的分離株間的核苷酸和氨基酸序列同源性均

14、高于處于不同分支上的分離株。當(dāng)把9個(gè)基因片段合并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)，所得的進(jìn)化樹(shù)和單個(gè)基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中cTV分離株間的聚類情況基本是一致的。在單個(gè)基因和基因片段合并構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，收集到的野生柑橘樣品上的11個(gè)CTV分離株并未在進(jìn)化樹(shù)中聚類在同一簇，而是分散在不同的組群中，和國(guó)內(nèi)外栽培品種上的CTV分離株聚類在一起，具有較復(fù)雜的親緣關(guān)系。然而具有相同癥狀的分離株聚類在同一簇上，說(shuō)明致病性是構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的關(guān)鍵岡素，與CTV起源和

15、進(jìn)化往往緊密相關(guān)。 4 總結(jié)綜上所述，柑橘在野生狀態(tài)下存在CTV的侵染，通過(guò)RFLP、SSCP分析發(fā)現(xiàn)感染的CTV分離株主要以p2.5/Hinf I RFLP單一組群構(gòu)成，構(gòu)成的主要組群同栽培品種上的主要組群相似。 從我國(guó)分離株和國(guó)外分離株間的核苷酸和氨基酸序列同源性、分離株序列間的遺傳變異分析以及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，分析的CTV 9個(gè)基因片段在進(jìn)化過(guò)程中承受著凈化選擇，并且我國(guó)柚的弱毒分離株CT9可能是不同于所有其它分離株的

16、我國(guó)獨(dú)有株系。我國(guó)野生柑橘上CTV的主要構(gòu)成組群同栽培品種上的相似，與國(guó)外栽培柑橘上的分離株有較高的序列相似性，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上同國(guó)內(nèi)外栽培品種上的CTV分離株親緣關(guān)系較近，分析的11個(gè)野生CTV分離株分散在由不同國(guó)家分離株聚類的組群中，且往往有相似生物學(xué)特性的CTV分離株聚類相同組群，表明病原致病性與CTV的起源和進(jìn)化有緊密關(guān)系，結(jié)合我國(guó)是柑橘的主要起源中心及柑橘的傳播過(guò)程，CTV在國(guó)內(nèi)外不同環(huán)境條件選擇壓力下的生存特點(diǎn)，推測(cè)我國(guó)可能是