不同誘導(dǎo)方法所得Treg樣細(xì)胞的多方面比較.pdf

1、目的：
　　 建立MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)法和TGF-β誘導(dǎo)法獲取調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)樣細(xì)胞的方法體系,比較兩種方法獲得Treg樣細(xì)胞的產(chǎn)率及其免疫抑制功能的差異,并初步探討兩種Treg樣細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用相關(guān)機(jī)制的差異。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMSCV-FOXP3,轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞,建立可穩(wěn)定產(chǎn)毒單克隆細(xì)胞株；采用差速離心法對(duì)病毒進(jìn)行濃縮

2、。
　　 2.免疫磁珠分選法獲取CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞；以CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,采用優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)和TGF-β誘導(dǎo)獲取Treg樣細(xì)胞,以流式細(xì)胞術(shù)和Real time PCR技術(shù)對(duì)兩種方法獲得Treg樣細(xì)胞的效率進(jìn)行檢測(cè)和比較。
　　 3.應(yīng)用活性染料CFSE染色和流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察兩種Treg樣細(xì)胞和天然Treg細(xì)胞對(duì)自體CD4+T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響,用ModFit軟

3、件分析CD4+T淋巴細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)模型。
　　 4.應(yīng)用ELISA技術(shù),檢測(cè)兩種Treg樣細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β的分泌水平；應(yīng)用Real time PCR技術(shù)檢測(cè)兩種Treg樣細(xì)胞顆粒酶A和顆粒酶B mRNA的轉(zhuǎn)錄水平差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建pMSCV-FOXP3重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞,篩選建立了穩(wěn)定產(chǎn)毒單克隆細(xì)胞株,最高病毒滴度為6×105cfu/ml。濃縮后病毒滴度可達(dá)1.2×

4、107cfu/ml。
　　 2.免疫磁珠分離獲得CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其純度為92.46％,CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞純度為90.82％,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率高于90％。當(dāng)病毒滴度為1×107cfu/ml時(shí),誘導(dǎo)獲得的Treg樣細(xì)胞產(chǎn)率最高,可達(dá)49.12％；當(dāng)TGF-β為5ng/ml,誘導(dǎo)時(shí)間為第6天時(shí),誘導(dǎo)獲得的Treg樣細(xì)胞產(chǎn)率最高,可達(dá)41.08％；MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)組CD4+T淋巴細(xì)胞

5、的FOXP3mRNA表達(dá)水平高于TGF-β組(P<0.05),MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)組CD4+T淋巴細(xì)胞的FOXP3蛋白陽(yáng)性率高于TGF-β組(P<0.05)。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞獲得的Treg樣細(xì)胞、TGF-β誘導(dǎo)獲得的Treg樣細(xì)胞以及天然型Treg細(xì)胞對(duì)自體CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用,與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4

6、.MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞獲得的Treg樣細(xì)胞與TGF-β誘導(dǎo)獲得的Treg樣細(xì)胞分泌IL-10水平明顯上升,與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。TGF-β誘導(dǎo)組和MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)組TGF-β分泌水平較對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。顆粒酶B在TGF-β誘導(dǎo)獲得Treg樣細(xì)胞表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。顆粒酶B在TGF-β誘導(dǎo)獲得Treg樣細(xì)胞表達(dá)水平較顯著高于MSCV-FOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)