嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎小鼠模型的建立及其蛋白組學(xué)研究.pdf

1、研究背景：嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎（eosinophilic bronchitis，EB）是以咳嗽為唯一或主要表現(xiàn)，肺通氣功能和氣道反應(yīng)性正常，誘導(dǎo)痰中嗜酸粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）明顯增多，皮質(zhì)激素治療有效的一類疾病。這一概念自1989年提出以來，引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。有人認(rèn)為EB是一種獨(dú)立的疾病，有人認(rèn)為它是哮喘的早期表現(xiàn)，但EB的發(fā)病原因、病理機(jī)制還不十分清楚。目前EB的研究主要集中于臨床患者，暫時(shí)還沒有一個(gè)確切的EB

2、動(dòng)物模型。鑒于直接進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的局限性，有關(guān)病因的確定、發(fā)病機(jī)制的探索、治療方法的評(píng)價(jià)、疾病的轉(zhuǎn)歸和新藥的研發(fā)在很大程度上需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。因此建立EB動(dòng)物模型對(duì)EB的深入研究具有重要意義。由于有大量相關(guān)分子生物學(xué)試劑及抗體供選擇，尤其是基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，小鼠在國內(nèi)外已成為主要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本課題擬采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，為進(jìn)一步研究EB的發(fā)病機(jī)制提供來源廣泛、成本低廉、背景簡(jiǎn)單、易于重復(fù)、可持續(xù)深入研究的EB動(dòng)物模型。<

3、br>　　 慢性咳嗽是EB患者主要或唯一的臨床癥狀，EB動(dòng)物模型也應(yīng)具有這一主要特征。由于小鼠生理解剖結(jié)構(gòu)微小，聲音信號(hào)極為微弱，小鼠有無咳嗽目前在國際上還存在很大爭(zhēng)議。目前最多使用小鼠咳嗽模型進(jìn)行研究的日本Junzo Kamei教授，主要通過觀察小鼠腹部急速抽搐運(yùn)動(dòng)同時(shí)合并異常呼吸波形來進(jìn)行小鼠咳嗽的判斷。由于沒有咳嗽聲音的檢測(cè)，因此說服力較弱，至今未得到國際公認(rèn)。小鼠咳嗽檢測(cè)成為制約小鼠EB模型建立的關(guān)鍵問題。建立基于小鼠咳嗽聲音

4、檢測(cè)基礎(chǔ)上的小鼠咳嗽檢測(cè)方法，不僅是小鼠EB模型的基礎(chǔ)條件，亦將為小鼠咳嗽模型得到國際公認(rèn)提供更有說服力的依據(jù)，為咳嗽機(jī)理研究和鎮(zhèn)咳藥物的篩選提供更多的選擇方式。
　　 基因是遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)是生命功能的直接執(zhí)行者，對(duì)蛋白質(zhì)的研究是跨越基因組與臨床應(yīng)用鴻溝的橋梁。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在臨床疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療研究中得到了廣泛應(yīng)用。如果能夠利用比較蛋白組學(xué)方法從臨床和動(dòng)物模型兩個(gè)方面研究EB與正常群體和哮喘之間的差異所

5、在，有可能找到EB疾病相關(guān)的生物標(biāo)志，為其診斷和治療干預(yù)提供新的視點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 1、建立小鼠咳嗽檢測(cè)方法；
　　 2、建立小鼠EB模型；
　　 3、篩選EB的疾病相關(guān)蛋白。
　　 研究?jī)?nèi)容：
　　 第一部分小鼠咳嗽檢測(cè)方法的建立方法：
　　 使用Buxco無創(chuàng)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)的密閉體描艙和本課題與美國Buxco公司合作開發(fā)的Finepointe（FP）小鼠咳嗽檢測(cè)軟件

6、，在小鼠處于自由活動(dòng)狀態(tài)時(shí)，使用100μmol/L辣椒素霧化激發(fā)，在記錄異常呼吸波形的同時(shí)，使用微型麥克風(fēng)監(jiān)聽小鼠聲音的性質(zhì)，使用cooledit聲音軟件進(jìn)行濾噪分析，逐步改進(jìn)小鼠咳嗽的檢測(cè)方法。使用可待因、辣椒平和辣椒素耗竭方法進(jìn)行干預(yù)，觀察小鼠咳嗽次數(shù)的變化，觀察人工計(jì)數(shù)和軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)的相關(guān)性和一致性。
　　 結(jié)果：
　　 建立了利用Buxco無創(chuàng)肺功能體描艙，使用FP小鼠咳嗽檢測(cè)軟件進(jìn)行小鼠咳嗽檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)：即在觀察

7、到小鼠咳嗽波形的同時(shí)能夠通過微型麥克風(fēng)監(jiān)聽到清晰咳嗽聲音，此時(shí)確定為一次小鼠咳嗽。經(jīng)多種鎮(zhèn)咳藥物干預(yù)后，小鼠咳嗽次數(shù)顯著減少。人工計(jì)數(shù)和軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)的相關(guān)性為0.964，一致性為0.956。
　　 結(jié)論：
　　 1.小鼠咳嗽檢測(cè)方法成功建立：該標(biāo)準(zhǔn)通過直接監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音并觀察異常呼吸波形變化來確定是否小鼠咳嗽，無需觀察小鼠腹部運(yùn)動(dòng)情況和分析聲波變化。方法可信、簡(jiǎn)單易行，有利于小鼠咳嗽模型的推廣和應(yīng)用，同時(shí)為小鼠EB模型

8、的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.小鼠咳嗽檢測(cè)軟件開發(fā)取得階段性成果：使用Buxco無創(chuàng)肺功能體描艙，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，開發(fā)的小鼠FP咳嗽檢測(cè)軟件具備較高的可信度，可為小鼠咳嗽模型的廣泛應(yīng)用起到推動(dòng)作用。
　　 第二部分嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎小鼠模型的建立
　　 分題1、OVA滴鼻誘發(fā)小鼠無氣道高反應(yīng)性嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥的劑量
　　 探索方法：
　　 SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，分為生理鹽水(n

9、ormal saline，NS)組、哮喘 (asthma，AS)組、低、中、高劑量雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)滴鼻模型組(model，M-1、M-2、M-3組)共5組，每組8只。致敏方法：第0、7、14天OVA (10μg)腹腔注射。第21、22、23天，3個(gè)模型組和AS組每天使用0.02％、0.04％、0.2％和0.4％OVA50μl滴鼻激發(fā)；NS組在相同時(shí)間內(nèi)使用NS進(jìn)行致敏和激發(fā)。末次激發(fā)24小時(shí) (hour，h) 后

10、應(yīng)用美國Buxco公司的有創(chuàng)氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測(cè)系統(tǒng)(RC system)測(cè)定動(dòng)物氣道反應(yīng)性、進(jìn)行支氣管肺泡灌洗觀察氣道炎癥、HE染色觀察氣道周圍炎癥細(xì)胞尤其是嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。
　　 結(jié)果：
　　 1.氣道反應(yīng)性檢測(cè)：末次激發(fā)24h后，各組基礎(chǔ)肺阻力無顯著差異。在吸入濃度為6.25、12.5、25、50mg/ml的乙酰甲膽堿(methacholine，MCh)時(shí)，AS組和NS組比較肺阻力(lung resista

11、nce，RL)顯著增高。在各個(gè)MCh濃度激發(fā)點(diǎn)，M-1組小鼠和NS組比較無顯著差異，而在6.25、12.5、25和50 mg/ml MCh激發(fā)點(diǎn)時(shí)，AS組小鼠肺阻力顯著高于M-1組小鼠。M-2組小鼠和M-3組小鼠的肺阻力介于NS組和AS組小鼠之間。
　　 2.肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：3個(gè)模型組和AS組BALF中巨噬細(xì)胞百分率顯著低于NS組，而中性粒細(xì)胞、EOS

12、和淋巴細(xì)胞百分率顯著高于NS組，其中以EOS比例增高明顯。
　　 3.肺組織病理學(xué)檢測(cè)：末次激發(fā)24h后，AS組小鼠支氣管周圍可見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以EOS浸潤(rùn)為主。各模型組亦出現(xiàn)輕-中度的氣管周圍炎(炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以EOS和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主)及水腫。NS組氣道纖毛上皮排列整齊，氣管/血管周圍無炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、無充血水腫。
　　 結(jié)論：
　　 使用10μg OVA腹腔致敏，10μg OVA滴鼻激發(fā)可成功建立無氣道

13、高反應(yīng)性嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥小鼠模型。
　　 分題2、小鼠咳嗽檢測(cè)對(duì)氣道反應(yīng)性檢測(cè)的影響
　　 方法：
　　 48只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，分成兩大部分，第一部分24只小鼠分為NS組、模型-1(M-1)組和AS組，按照分題1實(shí)驗(yàn)流程，常規(guī)造模行有創(chuàng)肺功能檢測(cè)氣道反應(yīng)性，以了解模型是否建立成功。OVA末次滴鼻激發(fā)后24h時(shí)，NS組小鼠首先使用辣椒素刺激進(jìn)行咳嗽檢測(cè)，隨后立即進(jìn)行氣道反應(yīng)性檢測(cè)，以了解辣椒素刺激

14、對(duì)NS組小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)的影響。其余24只實(shí)驗(yàn)小鼠3組，分別為模型-2(M-2)組、模型-3(M-3)組和模型-4(M-4)組。各組小鼠分別在OVA末次滴鼻激發(fā)后6h，12h，24h進(jìn)行咳嗽檢測(cè)，OVA末次滴鼻激發(fā)后24h時(shí)進(jìn)行氣道反應(yīng)性檢測(cè)，以了解辣椒素刺激對(duì)模型組小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)的影響。
　　 結(jié)論：
　　 模型建立后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用辣椒素刺激進(jìn)行小鼠咳嗽檢測(cè)對(duì)其后的小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)無影響。我們選擇在OVA末次

15、滴鼻后6h進(jìn)行咳嗽檢測(cè)，便于小鼠的正常作息及建立小鼠EB模型實(shí)驗(yàn)的時(shí)間安排。
　　 分題3、地塞米松對(duì)模型小鼠咳嗽和氣道反應(yīng)性的作用
　　 32只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，分為NS組、模型組、AS組和地塞米松組，每組8只。地塞米松組小鼠在模型組基礎(chǔ)上，每次OVA滴鼻激發(fā)前1h及行氣道反應(yīng)性檢測(cè)前1h予地塞米松進(jìn)行干預(yù)。各組小鼠在OVA末次滴鼻激發(fā)后6h行咳嗽檢測(cè)，末次滴鼻激發(fā)后24h進(jìn)行有創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測(cè)，進(jìn)行支氣管

16、肺泡灌洗觀察氣道炎癥，HE染色觀察氣道周圍炎癥細(xì)胞尤其是EOS的浸潤(rùn)程度。
　　 結(jié)果：
　　 1.咳嗽檢測(cè)：OVA末次滴鼻激發(fā)后6h模型組和AS組小鼠咳嗽次數(shù)顯著高于NS組；經(jīng)地塞米松預(yù)處理后小鼠咳嗽次數(shù)較模型組顯著降低；與NS組比較無顯著差異。
　　 2.氣道反應(yīng)性檢測(cè)：OVA末次滴鼻激發(fā)后24h，AS組小鼠在MCh為6.25-50mg/ml激發(fā)濃度時(shí)與NS組和模型組比較均有顯著差異；在MCh各個(gè)激發(fā)濃度下，

17、NS組和模型組比較均無顯著差異；地塞米松組小鼠氣道反應(yīng)性在MCh濃度為12.5mg/ml時(shí)較NS組輕度增高，其它各MCh濃度激發(fā)下與模型組和NS組比較均無顯著差異。
　　 3.BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：NS組小鼠肺泡灌洗液中EOS含量很少，不到1％，以Mac為主；經(jīng)OVA激發(fā)后，模型組、AS組EOS和Neu顯著增高，Mac含量顯著下降；地塞米松干預(yù)后，EOS和Neu水平較模型組和AS組顯著降低，但不能恢復(fù)到正常水平。