尼古丁在吸煙導(dǎo)致氣道慢性炎癥中的獨特效應(yīng).pdf

1、目的：比較單純尼古丁與煙草抽提物對培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞的效應(yīng)特點，并進(jìn)一步了解經(jīng)香煙和尼古丁誘導(dǎo)后的改變規(guī)律，以及相關(guān)炎性因子表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)差異，明確尼古丁在致炎抗炎及黏液高分泌方面的功過地位；同時明確尼古丁作用的膜受體在正常氣道的分布規(guī)律及表型；并進(jìn)一步了解尼古丁可能存在的抗炎效應(yīng)的分子機(jī)制及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)。為香煙成份改良提供努力方向，為尼古丁替代療法提供理論依據(jù)，同時幫助完善對尼古丁外周作用的認(rèn)識，有助于進(jìn)一步拓展尼古丁的有益使用范圍

2、。
　　 方法：（1）體外培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞系HBE16細(xì)胞，予以不同濃度的香煙氯仿抽提物（CE）、尼古丁刺激，選取最佳作用濃度。觀察刺激前后細(xì)胞的生長和增殖情況，采用ELISA技術(shù)測定各組細(xì)胞經(jīng)CE、尼古丁、脂多糖（LPS）刺激后培養(yǎng)上清中前炎性因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-8、IL-6及黏蛋白（MUC）5AC蛋白相對含量，real-time PCR檢測細(xì)胞中上述因子的轉(zhuǎn)錄水平變化情況，免疫熒光化學(xué)法觀察細(xì)胞

3、中MUC5AC的表達(dá)情況。（2）以人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞為陽性對照，分別設(shè)立CE組、尼古丁組，采用Western印跡分析及real-time PCR檢測各細(xì)胞組中煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）各亞型的表達(dá)情況，并采用相關(guān)亞型特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，ELISA檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-8、IL-6及MUC5AC蛋白水平的變化，real-time PCR檢測上述因子在基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。（3）進(jìn)一步將細(xì)胞分

4、為CE組、LPS組、尼古丁+CE組、尼古丁+LPS組，尼古丁+CE+α-BTX組，尼古丁+LPS+α-BTX組，以Western印跡分析各處理組細(xì)胞中磷酸化Ⅰ-κBα、Ⅰ-κBα蛋白的表達(dá)情況、細(xì)胞核中核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κBp65的蛋白含量；并采用pNF-κB-Luc熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法以檢測各組中NF-κB的活性；檢測加入NF-κB抑制劑PDTC后對細(xì)胞TNF-α、IL-8、IL-6的蛋白及基因表達(dá)水平的影響情況；同時檢測了各

5、組細(xì)胞中細(xì)胞外信號激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）及p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化蛋白表達(dá)情況，并觀察細(xì)胞經(jīng)單純CE及尼古丁刺激后不同時點上述MAPK信號因子的表達(dá)及變化情況。
　　 結(jié)果：（1）分別選取100μg/mL的CE及20μM的尼古丁為最適作用濃度，LPS的作用濃度為10μg/mL，分為不同組孵育細(xì)胞。檢測到CE、LPS刺激后細(xì)胞中TNF-α、IL-8、IL-6、MUC5ACm

6、RNA相對含量及培養(yǎng)液上清中。TNF-α、IL-8、IL-6、MUC5AC蛋白相對含量均有明顯增加，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；而給予尼古丁孵育的細(xì)胞上述指標(biāo)與正常對照組相比，并未見明顯升高，差別無統(tǒng)計學(xué)意義；免疫熒光檢測到MUC5AC在胞漿中的表達(dá)也較CE、LPS組弱；當(dāng)尼古丁分別與CE、LPS共同作用細(xì)胞后，檢測到兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-8、IL-6蛋白及細(xì)胞中mRNA的相對含量較CE、LPS單獨孵育組均有顯著下降

7、，P<0.05；尼古丁與CE、尼古丁與LPS共同孵育組中上清MUC5AC的蛋白分泌水平也有明顯下降，P<0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，但兩組細(xì)胞中MUC5AC mRNA表達(dá)與單獨CE組、LPS組相比，并未有明顯下降。（2）培養(yǎng)的人HBE16氣道上皮細(xì)胞中，α1、α5、α7、β2 nAChR mRNA均有明顯表達(dá)，尼古丁刺激組中上述指標(biāo)的表達(dá)高于正常對照組及CE刺激組；正常組HBE16細(xì)胞、經(jīng)CE及尼古丁刺激后的HBE16細(xì)胞，均未見僅α2

8、、α4、β1 nAChR mRNA表達(dá)；經(jīng)尼古丁刺激后，見少量α3 nAChR mRNA表達(dá)。細(xì)胞中α1、α5、α7、β2 nAChR蛋白均有明顯表達(dá)，尼古丁刺激組表達(dá)的量多于未予刺激的HBE16細(xì)胞組；未予尼古丁刺激的HBE16細(xì)胞組見微弱的α2、α3、α4蛋白表達(dá)，而經(jīng)尼古丁刺激后，上述的蛋白表達(dá)并不明顯，兩組細(xì)胞均未見有明確的β1蛋白表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染α1 nAchR siRNA、α5nAchRsiRNA后再予以尼古丁及LPS處理，檢

9、測到培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-8、IL-6蛋白相對含量及細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平與尼古丁及LPS共同孵育組中相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，而α7 nAchR siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組經(jīng)尼古丁及LPS刺激后，培養(yǎng)上清中上述蛋白的相對含量及細(xì)胞中mRNA相對含量與LPS、尼古丁共同刺激組相比，有明顯升高。（3）CE及LPS單獨刺激后，磷酸化-Ⅰ-κBα蛋白及細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白均有顯著增加，與正常對照組相比，P<0.01；加入尼古丁與CE及

10、LPS共同孵育的細(xì)胞組中，磷酸化-Ⅰ-κBα及NF-κBp65均出現(xiàn)明顯降低，與單獨CE、LPS孵育組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01；Ⅰ-κBα蛋白的含量未見明顯變化；尼古丁+CE+α-BTX組、尼古丁+LPS+α-BTX組中磷酸化-Ⅰ-κBα蛋白及NF-κBp65蛋白的含量與尼古丁+CE組、尼古丁+LPS組相比有明顯增加。轉(zhuǎn)染熒光素酶報告質(zhì)粒pNF-kB-luc后觀察到，尼古丁+CE組、尼古丁+LPS組中的熒光強(qiáng)度值小于CE組、

11、LPS組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01，尼古丁+CE+α-BTX組、尼古丁+LPS+α-BTX組中的熒光強(qiáng)度值出現(xiàn)增加，與尼古丁+CE組、尼古丁+LPS組相比，P<0.01。進(jìn)一步PDTC預(yù)處理細(xì)胞30min后，再分別予以CE、LPS刺激，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-8、IL-6蛋白相對含量及細(xì)胞mRAN水平較與單純CE刺激組、單純LPS刺激組相比均有明顯下降，P<0.01；尼古丁+CE組、尼古丁+LPS組中上述因子的蛋白相對含量

12、及mRNA相對含量也較單純CE組、單純LPS組有明顯下降；將細(xì)胞以PDTC預(yù)處理后，再分別施以尼古丁+CE、尼古丁+LPS刺激，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-8、IL-6蛋白相對含量下降更為明顯，與單純CE刺激組、單純LPS刺激組相比，P<0.01。細(xì)胞經(jīng)CE及LPS刺激后，可觀察到細(xì)胞中磷酸化p38 MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表達(dá)增多，與對照組相比，P<0.01；加入尼古丁孵育的細(xì)胞，再分別經(jīng)CE及LPS刺激，檢測到細(xì)胞中

13、磷酸化ERK1/2蛋白的相對含量顯著降低，分別為0.34±0.07、0.39±0.08，與單純CE組（0.74±0.12）、LPS組（0.79±0.13）相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01；而p38及JNK磷酸化蛋白未見有明顯減少。加入α7 nAChR特異性抑制劑α-BTX的尼古丁+CE及尼古丁+LPS組中，磷酸化ERK1/2蛋白的相對含量分別為0.59±0.11，0.63±0.13，與未加α-BTX刺激的尼古丁+CE組、尼古丁+LP

14、S組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01；但同樣對p38及JNK磷酸化蛋白的影響不大。進(jìn)一步觀察到HBE16細(xì)胞經(jīng)CE處理后，p38MAPK、pERK1/2及pJNK蛋白的表達(dá)隨時間延長而增強(qiáng)，6h時間點的表達(dá)水平明顯高于30min時的表達(dá)水平，P<0.01；經(jīng)尼古丁孵育的細(xì)胞，p38MAPK在作用30min后有表達(dá)，隨著時間延長表達(dá)逐漸降低，pERK1/2在各個時間點均未見明顯表達(dá)，pJNK在第30min開始表達(dá)，2h作用表達(dá)最強(qiáng)，在

15、第6h表達(dá)開始降低，與2h時間點的表達(dá)量相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01。
　　 結(jié)論：（1）尼古丁在香煙所致氣道黏液高分泌環(huán)節(jié)中并無過多正向效應(yīng)，相反，其可能通過減少該過程中致炎因子的產(chǎn)生，抑制后續(xù)過度炎癥反應(yīng)。（2）尼古丁能減少前炎性因子及重要炎性趨化因子TNF-α、IL-8、IL-6蛋白等的產(chǎn)生，具有一定的抗炎功能，且證實系通過與α7nAChR結(jié)合起降低Ⅰ-κBα磷酸化的作用，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位，發(fā)揮抑