高遷移率族蛋白B1在急性梗阻性化膿性膽管炎中表達(dá)及臨床意義.pdf

1、背景: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大鼠經(jīng)致死量脂多糖(LPS)處理后，TNF、IL-1b等早期致炎因子一般都在6h內(nèi)達(dá)到高峰，然后很快降回基礎(chǔ)水平，而大鼠仍在攻擊后數(shù)日內(nèi)死亡。這一現(xiàn)象提示內(nèi)毒素血癥致死亡過程中，存在一種遲發(fā)遞質(zhì)在起作用。用LPS刺激大鼠RAW264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后18h即可誘發(fā)一種分子量為30 000道爾頓(30kDa)的蛋白質(zhì)的出現(xiàn)，而在早期此種蛋白質(zhì)并不突出。分析證實(shí)這種遲發(fā)遞質(zhì)為大鼠高遷移率族蛋白B1(HMGB1)

2、。HMGB1是高遷移率族蛋白超家族(highmobility group，HMG)成員， HMG包括HMGB、HMGN、HMGA三大家族，其中HMGB1含有2個(gè)由約80個(gè)氨基酸組成的“L”型HMG box，分別是Abox(1-85aa)和B box(88-162aa)，是結(jié)合DNA的功能結(jié)構(gòu)域。其中Bbox是HMGB1發(fā)揮致炎功能的主要區(qū)域，而A box卻能競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMGB1的致炎功能。巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞在IL-1、TNF刺激后在胞內(nèi)

3、形成富含HMGB1的囊泡，細(xì)胞再以胞吐的方式將HMGB1釋放至胞外；同時(shí)，HMGB1也可刺激巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞釋放致炎因子，如TNF、IL-1α、IL-1b、IL-6、IL-8等。其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由激活的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。如內(nèi)毒素刺激可引起體內(nèi)TNF-α的釋放，而TNF-α的釋放可以引起其他因子如IL-1、集落刺激因子(CSF)等的釋放。這些細(xì)胞因子在機(jī)體炎癥的啟動(dòng)、維持、

4、消退等方面都起著重要的作用。白細(xì)胞介素10 (IL-10)是一種重要的抑炎因子，又名“細(xì)胞因子合成抑制因子”，其主要的生物學(xué)特點(diǎn)是激活單核-巨噬細(xì)胞抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)B細(xì)胞的釋放和免疫球蛋白分泌，對(duì)巨噬細(xì)胞的功能有免疫抑制作用。HMGB1、TNF-α和IL-10三種因子在各自的生物學(xué)特點(diǎn)上有所不同，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展、變化過程中起著不同的作用，同時(shí)三者之間又相互聯(lián)系。闡明三者間的相互關(guān)系，將對(duì)今后膿度癥的基礎(chǔ)研究以及臨床治療方

5、面提供有用的線索和信息。 目的:以急性梗阻性化膿性膽管炎(AOSC)內(nèi)毒素血癥患者為研究對(duì)象，測(cè)定膿毒癥患者血液中HIGB1、TNF-α和IL-10基因和蛋白的表達(dá)，初步探討HMGB1在膿毒癥患者血液中的表達(dá)情況，分析其臨床意義，為膿毒癥的臨床治療提供相關(guān)理論依據(jù)。 方法:按膿毒癥的定義和診斷標(biāo)準(zhǔn)，以2003年國(guó)際膿毒癥討論會(huì)定義的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)選擇病例。膿毒癥是指因感染引起的全身性炎癥反應(yīng)(SIRS)，體溫、循環(huán)、

6、呼吸有明顯的改變，是機(jī)體對(duì)感染的全身性反應(yīng)，具有2項(xiàng)SIRS的條件(SIRS+感染證據(jù))。SIRS包括下列兩項(xiàng)或兩項(xiàng)以上體征：體溫>38℃或<36℃；心率>90次/min；呼吸>20次/min；PaCO<,2><4.27 kPa；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×10<'9>/L或<4×10<'9>/L，或末成熟粒細(xì)胞>10％。AOSC為膿毒癥的典型代表，按照人民衛(wèi)生出版社，2003．7第6版本科醫(yī)學(xué)教材．外科學(xué)關(guān)于AOSC診斷標(biāo)準(zhǔn)： Reyno

7、lds五聯(lián)征：(1)腹痛(2)寒戰(zhàn)高熱(3)黃疸(4)休克表現(xiàn)(5)神經(jīng)中樞系統(tǒng)受抑制表現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)室檢查：(1)白細(xì)胞記數(shù)和中性粒細(xì)胞升高(2)血小板記數(shù)降低(3)凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)等；影像學(xué)檢查；或膽道感染的Charcot三聯(lián)征：(1)腹痛(2)寒戰(zhàn)高熱(3)黃疸；體溫39℃以上，脈搏>120次/分，白細(xì)胞>20×10<'9>/L，血小板記數(shù)降低。滿足以上條件的病例納入研究范圍，共納入23例病例。健康志愿者，排除機(jī)體內(nèi)有感染存在，共納入2

8、3例病例。 1．HMGB1 B box基因轉(zhuǎn)錄水平的差異：正常人外周血和手術(shù)前和手術(shù)后12h、24h、36h AOSC病人外周血單個(gè)核細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增人HMGB1 B box cDNA?？俁NA提取和RT-PCR試劑盒均購(gòu)買商品化成品，RT-PCR采用兩步法，對(duì)提取的總RNA和RT-PCR產(chǎn)物分別做瓊脂糖凝膠電泳。 2．HMGB1 B box基因表達(dá)水平的差異：對(duì)AOSC病人手術(shù)前和手術(shù)后12h、2

9、4h、36h和正常人血清中HMGB1的含量做Western-blot (免疫印記)檢測(cè)。 3．TNF-α和IL-10差異：采用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附)法檢測(cè)正常人外周血和手術(shù)前和手術(shù)后AOSC病人外周血中TNF-α和IL-10含量的變化。 4．對(duì)以上三項(xiàng)檢測(cè)的結(jié)果均應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示，在典型的膿毒癥-急性梗阻性化膿性膽管炎患者中，外周血單個(gè)核細(xì)胞中HMGB

10、1 mRNA表達(dá)量(0.82±0.04)比正常對(duì)照(0.31±0.06)明顯增高(P<0.01)，膽道引流術(shù)后125時(shí)為0.46±0.05，24小時(shí)為0.38±0.07，與手術(shù)前相比逐漸降低(P<0.01)。 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，在典型的膿毒癥一急性梗阻性化膿性膽管炎患者中，外周血血清中HMGB1蛋白的表達(dá)量(0.81±0.03)比正常對(duì)照(0.35±0.05)明顯增高(P<0.01)，膽道引流術(shù)后12小時(shí)為

11、0.56+0.05，24d,時(shí)為0.36±0.07，與手術(shù)前相比逐漸降低(P<0.01)。 ELISA結(jié)果顯示，AOSC患者血清中TNF-α與IL-10的含量分別為469±35pg/ml和33.369±6.443pg/ml比正常對(duì)照(102±16pg/ml、11.490±1.088pg/ml)明顯增高(P<0.01)；治療后隨著病情好轉(zhuǎn)，手術(shù)后12小時(shí)分別為243±26 pg/ml和20.562±5.630 pg/ml，與手術(shù)前