內(nèi)毒素耐受小鼠脾臟CD11clowCD45RBhigh DCs分離鑒定.pdf

1、研究背景與目的:
　　急性肝衰竭(ALF)是由各種原因?qū)е麓罅扛渭?xì)胞壞死及凋亡，使肝臟生理功能遭到嚴(yán)重?fù)p害。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，肝細(xì)胞的大量壞死和凋亡可導(dǎo)致全身炎癥綜合征，最終誘導(dǎo)急性肝衰竭。預(yù)先給予小劑量LPS或類似物質(zhì)刺激機(jī)體或單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)后，機(jī)體或細(xì)胞對致死劑量的LPS表現(xiàn)為低反應(yīng)性或無反應(yīng)性的現(xiàn)象，稱為內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance，ETT)。我們既往研究顯示內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下肝組織炎性壞死及肝功能損害的

2、嚴(yán)重程度明顯減輕，體內(nèi)炎性介質(zhì)水平及內(nèi)毒素下降，抗內(nèi)毒素能力增強(qiáng)，由此推測可能與負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能增強(qiáng)有關(guān)。
　　樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，也是體內(nèi)唯一能活化靜息T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cellsAPC)，DCs不僅能激活初始T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫應(yīng)答，而且在誘導(dǎo)免疫耐受方面也具有重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，從白細(xì)胞介素-10(IL-10)轉(zhuǎn)基因小

3、鼠和正常BALB/c、C57BL/6小鼠脾臟分離出新的樹突狀細(xì)胞(DCs)亞群CD11clowCD45RBhighDCs，具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能，可能有助于抑制失控性炎癥反應(yīng)，維持機(jī)體免疫平衡。
　　本實(shí)驗(yàn)通過建立內(nèi)毒素耐受模型小鼠，提取正常小鼠脾臟CD11clowCD45RBhighDCs及內(nèi)毒素耐受小鼠脾臟CD11clowCD45RBhigh DCs，觀察其數(shù)量、形態(tài)，流式檢測細(xì)胞表型，MTT檢測T細(xì)胞增殖抑制率，ELISA法測

4、上清液中IL-10及IL-12含量，了解內(nèi)毒素耐受小鼠脾臟CD11clowCD45RBhigh DCs免疫功能特點(diǎn)，為探討內(nèi)毒素耐受脾臟CD11clowCD45RBhigh DCs在肝衰竭中的潛在應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　?、賱?dòng)物模型的建立
　　健康BALB/c小鼠12只，隨機(jī)分為正常組（6只）和內(nèi)毒素耐受組(ETT)（6只）。正常組:腹腔注射生理鹽水0.2 ml，每日1次，連續(xù)5天;ETT組:腹腔注射0.2

5、ml LPS（0.5ug/ml，溶于生理鹽水中），每日1次，連續(xù)5天。
　?、贛ACS分選CD11clowCD45RBhigh DCs細(xì)胞
　　采用10％水合氯醛麻醉，打開腹腔，無菌取脾，將無菌采集的小鼠脾臟置于400目銅網(wǎng)，加入適量PBS用研杵輕柔研磨，邊研磨邊加入PBS，收集濾下單細(xì)胞懸液，然后離心棄上清。用適量緩沖液重懸，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離樹突狀細(xì)胞。經(jīng)免疫磁珠分選(magnetic cell sorti

6、ng，MACS)技術(shù)分選正常CD11clowCD45RBhigh DCs以及內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs。
　?、巯嗖铒@微鏡及掃描電鏡觀察CD11clowCD45RBhigh DCs形態(tài)
　　將富含CD11clowCD45RBhigh DCs的細(xì)胞懸液滴在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，用PBS沖洗，2.5％的戊二醛固定，室溫1h后，置于相差顯微鏡下及掃描電鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)。
　　④CD11cl

7、owCD45RBhigh DCs細(xì)胞的流式鑒定
　　將上述MACS分選后的兩組細(xì)胞，加入細(xì)胞MHC-Ⅱ、CD40、CD80等流式抗體，上機(jī)流式細(xì)胞儀鑒定其各組表現(xiàn)。
　?、軲TT法檢測T細(xì)胞增殖抑制率
　　將脾臟分離所得的T細(xì)胞按1.0×106/mL接種于96孔板，同時(shí)加入一定比例經(jīng)MMC滅活的的正常組CD11clowCD45RBhigh DCs、內(nèi)毒素耐受組CD11clowCD45RBhighDCs，以完全培養(yǎng)基為空

8、白對照組，每組各6孔，培養(yǎng)24h;各組加入MTT試劑，在酶標(biāo)儀570nm波長測各孔吸光度(A)值，并計(jì)算抑制率。
　?、轊LISA法檢測上清液中IL-10及IL-12
　　ELISA法檢測上述混合培養(yǎng)24h后的上清液中IL-10及IL-12的相對水平，將上清液按一定比例稀釋后，加入96板孔中，與已知蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)共同測量OD值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　正常組:每只小鼠脾臟CD11clowCD45RBhig

9、h DCs經(jīng)磁珠分選后濃度僅為30％左右，產(chǎn)量約(5.3±0.12)×105個(gè)，細(xì)胞存活率在90％以上，相差顯微鏡下可見少量樹突樣細(xì)胞，掃描電鏡觀察到細(xì)胞表面粗糙，邊緣短小毛刺樣突起。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測提示低表達(dá)MHC-Ⅱ(39.2％)，中度表達(dá)CD40(45.6％)、CD80(47.6％)。MTT法檢測CD11clowCD45RBhigh DCs可以抑制T細(xì)胞的增殖，并且隨著CD11clowCD45RBhigh DCs濃度增加，對T細(xì)胞

10、增殖的抑制更明顯。ELISA法提示其混合培養(yǎng)液IL-10分泌量與對照組比較分泌水平增加，呈濃度依賴性;IL-12分泌量與對照組比較分泌水平下降，當(dāng)CD11clowCD45RBhigh DCs與T細(xì)胞的比例為1∶100時(shí)，IL-12分泌水平達(dá)最低。
　　內(nèi)毒素耐受組:每只小鼠脾臟CD11clowCD45RBhigh DCs經(jīng)磁珠分選后濃度約80％，產(chǎn)量約(1.2±0.13)×106個(gè)，細(xì)胞存活率在90％以上，相差顯微鏡下可見具有樹突

11、樣突起的細(xì)胞，掃描電鏡觀察到細(xì)胞表面粗糙，邊緣短小毛刺樣突起。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示低表達(dá)MHC-Ⅱ(23.5％)、CD40(29.2％)、CD80(15.2％)，MTT法檢測耐受組CD11clowCD45RBhigh DCs與正常CD11clowCD45RBhigh DCs比較，可明顯抑制T細(xì)胞的增殖，呈濃度依賴性。ELISA法提示耐受組CD11clowCD45RBhigh DCs混合培養(yǎng)上清液中IL-10分泌量與正常CD11clowC

12、D45RBhighDCs比較分泌水平明顯增加，呈濃度依賴性;耐受組CD11clowCD45RBhigh DCs混合培養(yǎng)上清液中IL-12分泌量與正常CD11clowCD45RBhigh DCs比較分泌水平明顯下降。
　　結(jié)論:
　　①采用免疫磁珠分選兩組小鼠脾臟均可提取CD11clowCD45RBhigh DCs，數(shù)量有所差異。
　?、趦?nèi)毒素耐受組小鼠脾臟CD11clowCD45RBhigh DCs較正常組小鼠脾臟CD