木疏膠囊抗肝纖維化的動(dòng)物研究和臨床觀察.pdf

1、[研究背景與目的] 肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluarmatrix，ECM)的增生與降解失去平衡，從而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過(guò)程，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)之路。近年來(lái)明確提出了肝纖維化完全有可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)，因而，肝纖維化的研究已成為世界肝病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。中醫(yī)藥辨病與辨證相結(jié)合，多途徑，多層次，整體調(diào)控，在慢性肝病的治療中發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 前期實(shí)驗(yàn)已證

2、實(shí)木疏膠囊能明顯改善肝纖維化大鼠的肝功能，預(yù)防治療可降低血清纖維化相關(guān)酶，顯著改善肝組織病理學(xué)損害，有效地干預(yù)大鼠肝纖維化，并證明其機(jī)理可能與抗氧化、抑制肝臟TIMP-1表達(dá)而減少膠原合成，促進(jìn)降解有關(guān)，本研究是在這樣的結(jié)論基礎(chǔ)上，從體液免疫和細(xì)胞免疫的角度研究木疏膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，并通過(guò)分子生物學(xué)手段研究揭示其對(duì)肝纖維化相關(guān)因子基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其抗纖維化機(jī)制，同時(shí)也觀察其臨床療效，從而為木疏膠囊的臨

3、床應(yīng)用提供依據(jù)，以期為抗肝纖維化治療研究和臨床慢性肝病的防治提供新的選擇。 [實(shí)驗(yàn)方法] 一、誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型 肝纖維化動(dòng)物模型：造模各組于實(shí)驗(yàn)第1天皮下注射40％CCL40.5ml/100g體重，以后每4d皮下注射40％CCL4油溶液0.3ml/100g體重，連續(xù)8周。Wister大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，木疏膠囊預(yù)防組和治療組，鱉甲軟肝片預(yù)防組和治療組。預(yù)防實(shí)驗(yàn)造模同時(shí)正常對(duì)照組及模型對(duì)照組每天

4、蒸餾水灌胃，木疏膠囊預(yù)防組木疏膠囊3.125g/kg/d溶于5ml蒸餾水后，分2次灌胃，鱉甲軟肝片預(yù)防組鱉甲軟肝片0.625g/kg/d溶于5ml蒸餾水后，分2次灌胃，治療實(shí)驗(yàn)于造模結(jié)束后正常對(duì)照組及模型對(duì)照組蒸餾水5ml/d，分2次灌胃，木疏膠囊治療組木疏膠囊3.125g/kg/d溶于蒸餾水5ml后，分2次灌胃，鱉甲軟肝片治療組鱉甲軟肝片0.625g/kg/d溶于5ml蒸餾水后，分2次灌胃，共4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取肝右葉相同部位組織HE染色

5、和Masson染色觀察肝組織病理改變。 二、木疏膠囊抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的免疫作用機(jī)制研究 放免法測(cè)定血清細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α，RT-PCR法檢測(cè)肝組織TNF-α基因表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血淋巴細(xì)胞CD4、CD8表達(dá)。 三、木疏膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化相關(guān)因子基因表達(dá)的影響 RT-PCR法檢測(cè)肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達(dá)。 四、木疏膠囊治療肝纖維

6、化的臨床觀察 肝硬化患者服用木疏膠囊治療3個(gè)月，觀察用藥后體征、癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的改變。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果] 一、四氯化碳皮下注射誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，病理證實(shí)與正常對(duì)照組大鼠差異有顯著性，模型成功。 二、木疏膠囊治療對(duì)肝纖維化大鼠血清IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α影響的結(jié)果為：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，IL-2下降，IL-6、IL-8及TNF-α升高，均有顯著性差異(P＜0.01)；各用藥組與模型

7、對(duì)照組比較，IL-2升高，IL-6、IL-8及TNF-α下降，均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；木疏膠囊預(yù)防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預(yù)防組和治療組進(jìn)行兩兩比較，對(duì)IL-2的升高作用及對(duì)IL-6的下降作用均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；對(duì)IL-8的降低作用木疏膠囊優(yōu)于鱉甲軟肝片(P＜0.05)；對(duì)TNF-α的降低作用為木疏膠囊預(yù)防組優(yōu)于鱉甲軟肝片(P＜0.05)，而木疏膠囊治療組與鱉甲軟肝片無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

8、 三、木疏膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TNF-α基因表達(dá)的影響結(jié)果為：模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，升高均有顯著性差異(P＜0.01)；各用藥組與模型對(duì)照組比較，TNF-α基因表達(dá)下降，均有顯著性差異(P＜0.01)；木疏膠囊預(yù)防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預(yù)防組和治療組進(jìn)行兩兩比較，木疏膠囊預(yù)防組與鱉甲軟肝片使TNF-α基因表達(dá)下降的作用相當(dāng)，均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；而木疏膠囊治療組使TNF-α基因表達(dá)下降的作用不及鱉甲軟肝片，均

9、有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)。 四、木疏膠囊對(duì)肝纖維化大鼠血清CD4、CD8、CD4/CD8影響結(jié)果為：模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，CD4、CD4/CD8下降均有顯著性差異，CD8下降無(wú)顯著性差異，但P值為0.052,非常接近具有顯著性差異的臨界值0.05；各用藥組與模型對(duì)照組比較，木疏膠囊預(yù)防組和治療組使CD4和CD4/CD8升高，均有顯著性差異(P＜0.05)，CD8升高，但無(wú)顯著性差異，鱉甲軟肝片預(yù)防組使CD

10、4升高，有顯著性差異(P＜0.05)，治療組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，鱉甲軟肝片使CD8和CD4/CD8升高，但均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；木疏膠囊預(yù)防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預(yù)防組和治療組進(jìn)行兩兩比較，顯示木疏膠囊與鱉甲軟肝片對(duì)CD4、CD8和CD4/CD8的升高作用相當(dāng)，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 五、木疏膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達(dá)的影響 模型對(duì)照組

11、與正常對(duì)照組比較，TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達(dá)下降，均有顯著性差異(P＜0.01)；各組與模型對(duì)照組比較，TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達(dá)升高，均有顯著性差異(P＜0.01)；木疏膠囊預(yù)防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預(yù)防組和治療組進(jìn)行兩兩比較，木疏膠囊降低TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達(dá)的作用優(yōu)于鱉甲軟肝片，均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。

12、六、木疏膠囊治療肝纖維化的臨床觀察 觀察木疏膠囊治療后患者食欲、腹脹、乏力、肝區(qū)不適應(yīng)用Kendall's等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果為均有明顯改善(P＜0.001或P＜0.05)；但肝區(qū)疼痛無(wú)明顯改善(P＞0.05)；白細(xì)胞和血紅蛋白較治療前升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值=0.0196)；血清白蛋白治療前后比較結(jié)果(P值=0.0537)非常接近產(chǎn)生顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨界值；凝血酶原時(shí)間治療后較治療前縮短，有顯著性差異(P值=0.0

13、109)。 [結(jié)論] 1、木疏膠囊可升高肝纖維化大鼠血清IL-2，降低IL-6、IL-8、TNF-a水平，使肝纖維化大鼠肝組織TNF-α基因表達(dá)下降，對(duì)肝纖維化大鼠體液免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用。 2、木疏膠囊可使肝纖維化大鼠血清CD4、CD4/CD8升高，對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用。 3、木疏膠囊可降低肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達(dá)，證明木疏膠囊