植物黃酮抗腫瘤效應(yīng)的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系及ROS相關(guān)作用機制研究.pdf

1、植物黃酮為一類天然植物多酚化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、谷類等植物性食物中，流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究證實，植物黃酮具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等廣泛、優(yōu)良的生物學(xué)效應(yīng)，特別是對于腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、血管生成以及耐藥性等各階段、各方面都具有顯著的抑制作用，植物黃酮抗腫瘤活性以其天然、低毒、高效而倍受關(guān)注。 植物黃酮發(fā)揮各種藥理作用的基礎(chǔ)在于其分子結(jié)構(gòu)，不同分子結(jié)構(gòu)的植物黃酮其藥理效應(yīng)可能存在很大差異，而黃酮分

2、子結(jié)構(gòu)中某些特定的取代基或結(jié)構(gòu)特征，對于植物黃酮發(fā)揮某一種特定藥理效應(yīng)可能是必需或極重要的，這些結(jié)構(gòu)元件被稱為關(guān)鍵結(jié)構(gòu).效應(yīng)元件，研究并分析植物黃酮特定分子結(jié)構(gòu)與其特定藥理效應(yīng)之間的構(gòu)效關(guān)系，闡明其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件，對于揭示植物黃酮特定藥理學(xué)作用的機制，以及尋找高效的植物藥和合成新藥都具有重要的參考價值。植物黃酮抗腫瘤研究一直為國內(nèi)外一個研究熱點，但絕大多數(shù)研究只側(cè)重于某一種植物黃酮的抗腫瘤效應(yīng)，對不同植物黃酮化合物的抗腫瘤作用的

3、差異研究較少，缺乏相互之間的比較，特別是對于植物黃酮特定分子結(jié)構(gòu)與其抗腫瘤效應(yīng)之間的構(gòu)效關(guān)系缺乏研究，其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件尚不清楚，因此值得深入探討。 植物黃酮等多酚類化合物作為優(yōu)良的天然抗氧化劑已眾所周知，但事實上植物黃酮可同時具有抗氧化和促氧化兩種相反特性。研究表明，在某些環(huán)境下(如O2大量存在或細胞過氧化物酶活性較高)，或某些因素誘導(dǎo)下(如過渡金屬Fe或Cu的催化)，植物黃酮可被過氧化物酶氧化生成酚自由基，并形成酚氧化

4、反應(yīng)鏈，這些酚過氧化物可催化谷胱甘肽或輔酶I共氧化并產(chǎn)生活性氧。植物黃酮對疾病的防治作用一般認為在于其優(yōu)良的抗氧化及清除自由基特性，然而近期研究發(fā)現(xiàn)，這些植物多酚物質(zhì)在抗腫瘤及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面，其促氧化活性可能比其抗氧化活性更加重要，因為ROS可以介導(dǎo)DNA片段化并導(dǎo)致凋亡發(fā)生，很多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡都與引發(fā)ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)，如抗腫瘤藥物三氧化二砷、順鉑、以及醌類抗癌藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中，胞內(nèi)：ROS的產(chǎn)生都發(fā)揮著

5、重要作用。 正常情況下，細胞內(nèi)：ROS的產(chǎn)生與消解處于動態(tài)平衡過程中，細胞內(nèi)環(huán)境氧化-還原狀態(tài)保持相對穩(wěn)定，而細胞氧化-還原狀態(tài)對于細胞的生存及各種功能都是至關(guān)重要的，破壞細胞氧化-還原狀態(tài)平衡的主要因素是ROS和GSH，現(xiàn)己知道，低微水平的ROS升高可促進細胞增殖，而較高水平的ROS則引發(fā)細胞凋亡，更高水平的ROS則直接導(dǎo)致細胞壞死。多項研究表明，腫瘤細胞內(nèi)的抗氧化酶如SOD和CAT等，其活性都顯著低于正常細胞，腫瘤細胞清除R

6、OS和生成GSH的能力較低，而腫瘤細胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生又往往遠高于正常細胞，因此腫瘤細胞內(nèi)存在嚴重的氧化壓力，對ROS十分敏感，ROS對腫瘤細胞具有選擇性殺傷力，近年來，人們已經(jīng)開始開發(fā)利用ROS誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的抗腫瘤新藥，而某些膳食多酚化合物，其特性例如與DNA結(jié)合、剪切DNA、在過渡金屬存在下產(chǎn)生ROS，都與一些抗腫瘤藥物相似。由此我們推斷，在腫瘤細胞內(nèi)特別是在細胞關(guān)鍵部位如細胞膜、線粒體膜表面及細胞核內(nèi)引發(fā)ROS，改變細胞氧化-

7、還原狀態(tài)平衡，對細胞內(nèi)關(guān)鍵靶點造成氧化壓力，從而啟動細胞凋亡，這可能是某些植物黃酮抗腫瘤作用的重要機制。 基于以上分析，本課題應(yīng)用槲皮素等23種分子結(jié)構(gòu)明確、純度單一的常見植物黃酮，作用于白血病HL-60細胞、乳腺癌MCF-7細胞、前列腺癌PC3細胞等6種不同腫瘤細胞，檢測評價不同植物黃酮對腫瘤細胞增殖的影響，分析植物黃酮不同分子結(jié)構(gòu)與其抗腫瘤效應(yīng)間的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系，以及其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件；同時篩選出3種抗腫瘤效應(yīng)強的植物

8、黃酮和對植物黃酮作用敏感的白血病HL-60細胞作為研究對象，運用流式細胞分析、激光共聚焦掃描顯微鏡、熒光漂白恢復(fù)等先進分子生物學(xué)檢測分析技術(shù)，深入研究植物黃酮誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中，其胞內(nèi)ROS、GSH和氧化-還原電位的變化，同時對于細胞中最易受ROS攻擊的細胞膜和線粒體，本課題進一步研究這些植物黃酮對腫瘤細胞膜流動性和線粒體膜電位的影響，并以抗氧化劑NAC進行干預(yù)實驗，探討植物黃酮抗腫瘤的ROS相關(guān)作用機制。 本研究主要實驗結(jié)

9、果和結(jié)論如下： 1.細胞增殖狀態(tài)檢測結(jié)果表明，被檢測的23種植物黃酮大部分對腫瘤細胞增殖都表現(xiàn)出顯著抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢，但不同植物黃酮之間存在較大差異，同時不同腫瘤細胞對植物黃酮作用表現(xiàn)出不同的敏感性，在被檢測的6種腫瘤細胞中，白血病HL-60細胞對于植物黃酮的細胞毒性作用最敏感，植物黃酮3,6-二羥基黃酮和2’-羥基二氫黃酮對6種腫瘤細胞表現(xiàn)出最強的增殖抑制效應(yīng)，柚皮素和橙皮素對于6種腫瘤細胞均無顯著增殖抑制作用，

10、而印棉黃素和桑黃素對于多種腫瘤細胞的增殖具有促進作用，以IC50為標準，比較植物黃酮抑制腫瘤細胞增殖效應(yīng)的強弱得出以下順序：3，6-二羥基黃酮＞2’-羥基二氫黃酮＞漆樹黃酮＞3，7-二羥基黃酮＞毛地黃黃酮＞5，7，4’-三羥基黃酮＞槲皮素＞6-羥基黃酮＞7-羥基黃酮＞4’-羥基二氫黃酮＞高良姜黃素＞3’-甲氧基，3，7，4’-三羥基黃酮＞黃芩黃酮＞大豆黃素＞白楊黃素＞楊梅黃酮＞染料木黃酮＞黃酮＞二氫黃酮＞柚皮素＞橙皮素＞桑黃素＞印棉黃素

11、。 2.細胞增殖檢測結(jié)果表明，在被檢測的23種植物黃酮中3,6-二羥基黃酮表現(xiàn)出最強的抗腫瘤效應(yīng)，進一步細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，10μM的3，6-二羥基黃酮處理24h，6種腫瘤細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)均發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為細胞生長稀疏，排列紊亂，大量細胞皺縮變圓，胞質(zhì)凝縮，并與其周邊細胞分離，細胞貼壁性下降，甚至離開瓶壁漂浮到培養(yǎng)基中，這些形態(tài)變化都是凋亡細胞或死亡細胞的表現(xiàn)特征；進一步DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察可見，正常腫瘤細

12、胞核呈現(xiàn)彌漫均勻的低強度熒光，出現(xiàn)凋亡形態(tài)(固縮形態(tài)的亮藍色顆粒)的比率很低，而3,6-二羥基黃酮處理24h后，6種腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)的比率均明顯升高；流式細胞凋亡分析結(jié)果也表明，10μM的3，6-二羥基黃酮處理24h，6種腫瘤細胞的凋亡率均顯著升高。這些實驗結(jié)果表明，3，6-二羥基黃酮具有很強的抗腫瘤效應(yīng)，可有效誘導(dǎo)6種腫瘤細胞凋亡。 3.植物黃酮抗腫瘤效應(yīng)的結(jié)構(gòu).效應(yīng)關(guān)系分析結(jié)果表明，植物黃酮分子中一定數(shù)目的羥基(2～4個

13、)、C環(huán)2,3位雙鍵、B環(huán)定位于2位、3位羥基、6位羥基、B環(huán)鄰位羥基，對于植物黃酮發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)可能是至關(guān)重要的，是其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件，相反，羥基數(shù)目的過少或過多、C環(huán)2,3位雙鍵的缺失、B環(huán)定位于3位(異黃酮結(jié)構(gòu))、5位羥基和B環(huán)間位羥基，則會降低植物黃酮分子的抗腫瘤效應(yīng)。 4.細胞ROS水平和凋亡檢測分析結(jié)果表明，HL-60細胞ROS水平顯著高于正常人淋巴細胞，而植物黃酮3，6-dihydroxyflavone、lu

14、teolin和geraldol作用HL-60細胞，均能引發(fā)ROS，造成ROS水平顯著升高，并有效誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，而hesperetin和naringenin對HL-60細胞增殖無顯著作用的植物黃酮，對HL-60細胞ROS水平無顯著影響，且對HL-60細胞凋亡狀況亦無顯著影響；進一步研究表明，3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol均能顯著降低HL-60細胞胞內(nèi)GSH水平，提高GSSG水平，導(dǎo)致

15、HL-60細胞氧化-還原電位顯著升高；膜流動性和線粒體膜電位檢測結(jié)果表明，3種植物黃酮可顯著降低HL-60細胞的膜流動性和線粒體膜電位水平。 5.NAC干預(yù)實驗結(jié)果表明，NAC干預(yù)可有效阻斷植物黃酮3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol對HL-60細胞誘發(fā)的ROS水平升高、GSH水平下降和細胞氧化-還原電位的升高，以及膜流動性和線粒體膜電位的下降，并部分降低3種植物黃酮對HL-60細胞的增殖

16、抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用。這些實驗結(jié)果表明，引發(fā)ROS和氧化-還原電位水平升高，在3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡過程中起著重要作用，通過引發(fā)ROS和細胞氧化.還原電位水平升高介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，是植物黃酮發(fā)揮抗腫瘤作用的一個重要機制。 綜上所述，本課題通過檢測及比較23種植物黃酮對多種腫瘤細胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)3，6-二羥基黃酮具有很強的抗腫瘤活性，結(jié)構(gòu).效應(yīng)關(guān)系

17、分析表明，一定數(shù)目的羥基(2～4個)、C環(huán)2,3位雙鍵、B環(huán)定位于2位、3位羥基、6位羥基、B環(huán)鄰位羥基，是植物黃酮發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件，同時作用機制研究表明，植物黃酮3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol可顯著提高HL-60細胞.ROS水平，降低GSH水平，提高細胞氧化-還原電位，降低細胞膜流動性和線粒體膜電位，誘導(dǎo)細胞凋亡，表明，引發(fā)ROS并提高細胞氧化-還原電位從而誘導(dǎo)凋亡，是植