天然水蛭素分離純化研究.pdf

1、水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中所含的一種蛋白質(zhì)，是迄今世界上已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凝血酶特效抑制劑，是一類很有前途的抗凝化瘀藥物。世界各地科學(xué)家都在研究水蛭素，有很多關(guān)于水蛭素的報(bào)道和專利，但以前人們關(guān)于水蛭素提取的報(bào)道大多數(shù)都要?dú)⑺勒麠l水蛭來(lái)獲得水蛭素，本實(shí)驗(yàn)以南寧科康生物有限公司養(yǎng)殖的菲牛蛭的提取物為原料，將其分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得活性更高的水蛭素產(chǎn)物。 實(shí)驗(yàn)首先是比較了硫酸銨分級(jí)沉淀鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pH沉淀法三種蛋白質(zhì)沉

2、淀法對(duì)水蛭素分離純化的效果，確定了利用硫酸銨分級(jí)沉淀鹽析對(duì)水蛭唾液分泌物進(jìn)行粗分離純化，通過(guò)多次離心分段鹽析和兩次離心分段鹽析效果表明：35％～55％飽和度的(NH<,4>)<,2>SO<,4>(W<,a>)是較理想的鹽析范圍，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳的正交實(shí)驗(yàn)條件為：40％飽和度的(CH<,4>)<,2>SO<,4>，pH為5.5，靜置時(shí)間為20 min，此時(shí)蛋白質(zhì)的回收率(W<,p>)=34.37％，水蛭素活性回收率(W<,h>)=6

3、9.33％，水蛭素純化倍數(shù)(R<,hp>)=2.02，比活(S<,p>)=5.33 AT-U/mg。在中間純化和精制過(guò)程中，比較了DEAE SephadexA-50和DEAE Sepharose CL-6B兩種離子交換層析樹(shù)脂的分離純化效果，確定利用DEAE Sepharose CL-6B作為離子交換層析法的樹(shù)脂對(duì)水蛭素進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。在以DEAE Sepharose CL-6B柱層析純化優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，考察了不同緩沖液、離子洗脫濃度

4、、上樣量及洗脫速度等因素對(duì)水蛭素分離純化效果的影響，得知在0.025 mol/mL磷酸鹽緩沖液，0～1.0 mol/mLNaCl的離子洗脫濃度，上樣量為100 mL，洗脫速度為30 mL/h的條件下蛋白質(zhì)的回收率=5.07％，水蛭素活性回收率=77.76％，水蛭素純化倍數(shù)(R<,hp>)=15.34，比活(S<,p>)=191.69 AT-U/mg。在以Sephadex G-25凝膠樹(shù)脂的柱層析脫鹽優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中考察了洗脫速度因素對(duì)水蛭素分

5、離純化效果的影響，得知在30mL/h的洗脫速度的條件下蛋白質(zhì)濃度=0.295 μg/mg，蛋白質(zhì)的回收率=0.27％，水蛭素活性回收率=47.88％，水蛭素純化倍數(shù)(R<,hp>)=8.73，比活(S<,p>)=1017 AT-U/mg。最后利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的分離和檢測(cè)，集中收集活性峰，檢測(cè)其純度在90％以上。另外，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定了收集到的水蛭素溶液的分子量分布情況并驗(yàn)證了其純度。天然水蛭素