促紅細胞生成素衍生肽減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　早期成功的再灌注治療是挽救急性缺血心肌的關(guān)鍵。然而，冠狀動脈在血供迅速改善的同時可造成嚴重的心肌損傷，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIR)，表現(xiàn)為嚴重的心律失常、內(nèi)皮功能障礙、心肌頓抑、細胞死亡等，減少了再灌注血流所帶來的獲益。因此，如何有效減輕這種損傷，使再灌注治療最大獲益成為急性心肌梗死治療的最大挑戰(zhàn)。
　　促紅細胞生成素（eryth

2、ropoietin，EPO）是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白激素，因其良好的促進造血功能而廣泛應用于臨床。近十年來體內(nèi)外大量的實驗證實EPO還可作為一種保護因子，作用于機體多種組織器官，包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟等，通過減少細胞凋亡、抗氧化、抑制炎癥反應、促血管生長等發(fā)揮其組織保護作用。其中，EPO在心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷等模型中良好的心肌保護作用更是受到廣泛關(guān)注。但EPO需要大劑量才能發(fā)揮組織保護作用，會造成對骨髓造血系統(tǒng)的

3、過度刺激，引起紅細胞、血小板增多，使血液粘度增加、循環(huán)阻力增大，增大高血壓和血栓形成的風險。近年來幾個大型臨床研究中，EPO因血栓及高血壓等不良反應，使其臨床推廣受到限制。
　　EPO有兩種受體亞型:同源二聚受體(EPOR)2和異二聚體復合物EPOR-βCR。EPO的促紅作用是由(EPOR)2受體介導的，而組織保護效應是由EPOR-βCR受體介導的。研究證實，敲除βcR基因可完全消除EPO對神經(jīng)系統(tǒng)及心臟的組織保護作用;2008年

4、Brines等根據(jù)這一特點，在與經(jīng)典的促紅受體(EPOR)2不結(jié)合的helix B段親水表面篩選了11個氨基酸(序列為:QEQLERALNSS)，合成了螺旋B表面肽（helix B surface peptide，HBSP），即促紅細胞生成素衍生肽，并證實其具有神經(jīng)組織保護作用而無促進紅細胞生成的副作用。
　　HBSP因其良好的臨床應用前景而受到廣泛關(guān)注，其在各種病理生理條件下的作用被廣泛研究。有研究顯示，HBSP能顯著減輕小鼠腎

5、臟缺血再灌注后腎小管上皮細胞損傷程度和凋亡水平。Ueba H等發(fā)現(xiàn)HBSP可以抑制TNF-α誘導的心肌細胞凋亡。Ahmet I等通過結(jié)扎前降支建立大鼠心梗后心衰模型，發(fā)現(xiàn)HBSP能夠減慢大鼠心梗后心室重塑和心衰的進程，改善心功能，并降低死亡率。另一項研究表明，HBSP能減輕大鼠心肌梗死中的心肌細胞凋亡和炎癥，減小心肌梗死面積，這一保護作用與ERK1/2，STAT3通路的激活有關(guān)。然而HBSP在心肌缺血再灌注損傷中是否起保護作用國外尚無相

6、關(guān)報道，其作用機制尚不明確。本研究擬通過建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討HBSP后處理在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其可能機制，有望為HBSP的多種組織保護作用提出新的見解，為心肌缺血再灌注損傷的臨床防治提供新的理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，證實HBSP后處理在心肌缺血再灌注損傷中的作用。
　　2.探索HBSP在小鼠MIRI中發(fā)揮心肌保護作用的可能機制。
　　研究方法:<

7、br>　　1.研究對象及實驗分組
　　本實驗選用SPF級ICR小鼠（雄性，體重25-30g）為研究對象。
　　小鼠被隨機分成4組:
　　(1)假手術(shù)（sham）組:小鼠冠狀動脈前降支只穿線但不結(jié)扎，在穿線40min時予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg);
　　(2)缺血再灌注(MIRI)組:予行缺血再灌注處理，再灌前5min予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg);
　　(3)HBSP組:予行缺血再灌注處理，再

8、灌前5min予腹腔注射HBSP(90μg/kg，10ml/kg);
　　(4)HBSP+PD98059組:予行缺血再灌注處理，再灌前20min予腹腔注射ERK1/2特異性阻斷劑PD98059（1mg/kg），再灌前5min予腹腔注射HBSP（90μg/kg，10ml/kg）。
　　2.小鼠MIRI模型的建立
　　小鼠稱重后經(jīng)腹腔注射甲苯噻嗪(5mg/kg)及氯胺酮(100mg/kg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，連接肢體

9、心電圖電極，描記標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖。經(jīng)口行氣管插管，連接小動物呼吸機。備皮并消毒后，經(jīng)胸骨左緣第3-4助間行開胸術(shù)，暴露左心耳，在其下約1mm處，用8-0號縫線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，可見結(jié)扎線以下心肌變白。心電圖實時監(jiān)測并記錄，ST段持續(xù)抬高說明造模成功，缺血45min后解除結(jié)扎線，再灌注120min。以ST段下移及缺血心肌漸恢復紅潤為再灌注成功標志。
　　3.小鼠心肌梗死面積的測定
　　再灌注2h后，原位結(jié)扎左前降支，采用伊

10、文氏藍和2，3，5—氯化三苯基四氮唑(TTC)雙染法檢測小鼠心肌梗死面積。缺血危險區(qū)(area at risk，AAR)為無藍染的區(qū)域，梗死區(qū)域為白色，存活心肌被染成磚紅色。用Image J圖像分析軟件測定心梗面積(infarct size，IS)，計算危險區(qū)面積/左室面積(AAR/LV)及梗死面積/危險區(qū)面積(IS/AAR)的比值。
　　4.血清LDH和CK的測定
　　再灌注2h后，取心臟之前，經(jīng)心尖取血0.5-1.0ml

11、，以3000r/min離心10min，取血清于-20℃中保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA法檢測各組乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)水平。
　　5.心肌細胞凋亡的檢測
　　再灌注2h后，取心臟固定、包埋、切片，采用TUNEL檢測試劑盒檢測心肌細胞凋亡率，以LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察記錄結(jié)果。每只小鼠計數(shù)10個隨機高倍視野中TUNEL陽性細胞核數(shù)和總細胞核數(shù)。計算TUNEL陽性細胞核數(shù)占總細胞核數(shù)的百分比即為凋亡率

12、。
　　6.ERK1/2、磷酸化ERK1/2及cleaved caspase3表達的檢測
　　再灌注2 h后，取結(jié)扎線以下左室心肌，將心肌組織剪碎研磨，加入細胞裂解液，提取總蛋白。蛋白定量后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用5％脫脂牛奶封閉1h后分別加入各自稀釋后的一抗，4℃共孵過夜，TBST洗膜兩次，分別加入相應二抗（1∶2000稀釋），37℃孵育1h，TBST洗膜三次后，進行化學發(fā)光顯影。采用Image p

13、ro plus6.0軟件分析目標條帶光密度值。
　　研究結(jié)果:
　　1.HBSP后處理減少小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積
　　再灌注2h后，與MIRI組相比，HBSP組心肌梗死面積明顯縮小，HBSP+PD98059組心梗面積較HBSP組有所增加[三組IS/AAR分別為（47.1±7.4）％、(24.2±3.8)％和（38.4±2.2）％，P＜0.05]，說明HBSP后處理能夠減少小鼠MIRI后心肌梗死面積，而給予ER

14、K1/2特異性阻斷劑PD98059后，HBSP的這種保護作用被部分抑制。各組AAR/LV無明顯差異（P＞0.05）。
　　2.HBSP后處理減少小鼠心肌缺血再灌注后LDH和CK的釋放
　　再灌注2h后，MIRI組LDH水平明顯高于sham組（878.2±133.0 vs.175.5±53.4U/L，P＜0.05）;而HBSP組與MIRI組相比，LDH明顯降低（625.5±110.7vs.878.2±133.0U/L，P＜0.

15、05）;HBSP+PD98059組LDH較HBSP組有所升高(742±117.4 vs.625.5±110.7U/L，P＜0.05)。與sham組相比，MIRI組CK水平顯著升高(P＜0.05);而與MIRI組相比，HBSP組CK明顯降低(P＜0.05);HBSP+PD98059組CK較HBSP組有所升高（P＜0.05）。
　　3.HBSP后處理減輕小鼠心肌缺血再灌注后的心肌細胞凋亡
　　再灌注2小時后，與sham組相比，M

16、IRI組心肌細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05);而同MIRI組相比，HBSP組細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05);HBSP+PD98059組細胞凋亡率較HBSP組增加（P＜0.05），四組的細胞凋亡率分別為（5.5±1.1）％、(29.4±5.1)％、（15.0±2.3）％和（21.8±2.5）％。
　　4.HBSP后處理抑制小鼠心肌缺血再灌注后的cleaved caspase3的表達
　　再灌注2h后，MIRI組cleav

17、ed caspase3表達較sham組顯著升高（1.75±0.21 vs.0.29±0.06，P＜0.05）;而HBSP組與MIRI組相比，cleaved caspase3表達明顯降低（0.60±0.12 vs.1.75±0.21，P＜0.05）;HBSP+PD98059組cleaved caspase3表達較HBSP組有所升高(1.04±0.12 vs.0.60±0.12，P＜0.05)。
　　5.HBSP后處理提高小鼠心肌缺血

18、再灌注后ERK1/2的磷酸化水平
　　再灌注2小時后，MIRI組磷酸化ERK1/2水平較sham組升高（P＜0.05）;與MIRI組相比，HBSP可以上調(diào)磷酸化ERK1/2的表達(P＜0.05);而在給予ERK1/2特異性阻斷劑PD98059后，ERK1/2的磷酸化被顯著抑制(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　HBSP后處理可以減輕小鼠MIRI中的心肌細胞損傷，抑制心肌細胞凋亡，縮小心肌梗死面積，發(fā)揮心肌保護作用。