CHB患者外周血IL-35的表達(dá)及其與Treg細(xì)胞之間的關(guān)系.pdf

1、目的：1.通過檢測慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血白細(xì)胞介素-35(IL-35)的表達(dá)水平，探討IL-35在CHB患者外周血中的表達(dá)水平及其與肝功能之間的關(guān)系。
　　2.通過分析CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中IL-35兩個(gè)亞基EBI3和IL-12p35與Foxp3 mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)關(guān)系，明確IL-35與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)功能之間的關(guān)系。
　　3.通過磁珠分選獲得CD4+CD25+Treg和CD4+C

2、D25-T細(xì)胞并刺激不同的時(shí)間，明確IL-35是否由Treg細(xì)胞分泌及其不同活化狀態(tài)下IL-35表達(dá)水平的變化。
　　方法：1.采集125例慢性HBV感染者，其中包括27例慢性乙型重型肝炎(CSHB)、69例慢性乙型肝炎(CHB)、29無癥狀攜帶者(ASC)，26例正常對照(NC)外周血，留取血清，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測IL-35的表達(dá)水平，全自動生化儀檢測肝功能，半自動血凝儀檢測凝血功能，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PC

3、R)檢測HBV DNA，分析慢性HBV感染者IL-35的表達(dá)水平，并與部分肝功能指標(biāo)，PT及HBV DNA進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.采集20例CSHB、40例CHB、15例ASC和15例NC外周抗凝血3 ml，F(xiàn)icolli密度梯度離心法獲取PBMC，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組EBI3、IL-12p35及Foxp3的mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3

4、.磁珠分選獲得CD4+CD25+Treg和CD4+CD25·T細(xì)胞，加入抗CD3、抗CD28抗體和IL-2進(jìn)行刺激，在不同的時(shí)間點(diǎn)(0、3、5、7天)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測胞內(nèi)因子IL-12p35，RT-PCR檢測EBI3、IL-12p35、Foxp3、TGF-β和IL-10的mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-35、IL-1O和TGF-β的表達(dá)水平，分析不同活化狀態(tài)下IL-35的表達(dá)水平變化情況。
　　

5、結(jié)果：1.慢性HBV感染者血清中IL-35的表達(dá)水平明顯高于NC(P<0.05)；CSHB、CHB、ASC和NC血清中IL-35的表達(dá)水平呈遞減趨勢，各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清中IL-35的表達(dá)水平與ALT、AST、TBIL和PT呈正相關(guān)，與ALB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與HBV DNA無明顯相關(guān)(P<0.05)。
　　2.CSHB患者EBI3、IL-12p35和Foxp3的mRNA表達(dá)水平高于CHB、ASC和

6、NC，CHB患者高于ASC和NC，ASC高于NC，各組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：EBI3、IL-12p35與Foxp3的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，EBI3與IL-12p35的mRNA表達(dá)水平也呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　3.未活化的CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)少量的胞內(nèi)IL-12 p35，經(jīng)活化后(3、5、7天)其表達(dá)水平伴隨時(shí)間延長而升高(P<0.05)，未經(jīng)活化的CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)少量的IL-1

7、2 p35，經(jīng)活化后其表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。
　　4.未活化和活化的CD4+CD25+Treg細(xì)胞均可檢測到EBI3、IL-12p35、Foxp3和IL-10、TGF-β mRNA，且其表達(dá)水平伴隨著活化時(shí)間延長而升高(P<0.05)。
　　5.活化的CD4+CD25+Treg細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-35、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平伴隨著活化時(shí)間延長而升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.CHB患者外周血