雞OC-116翻譯后糖胺聚糖修飾相關(guān)酶的初步鑒定.pdf

1、OC-116蛋殼基質(zhì)蛋白是蛋殼形成過程中重要的有機(jī)基質(zhì)組分,OC-116蛋殼基質(zhì)糖胺聚糖酶有多種功能,但是其在蛋殼形成過程中的具體表達(dá)機(jī)制尚無研究報(bào)道。本研究篩選雞OC-116編碼基因真核表達(dá)載體,使用真核細(xì)胞表達(dá)重組子轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而對(duì)雞OC-116翻譯后糖胺聚糖修飾相關(guān)酶進(jìn)行初步鑒定。
　　1)雞 OC-116編碼基因真核表達(dá)載體的篩選:本研究制備了 OC116-GFP、OC116-pcDNA、OC116(M1)-pcD

2、NA和OC116(M1)-GFP四種重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO),瞬時(shí)表達(dá)后制備 cDNA、提取總蛋白,利用 Real-time PCR的方法驗(yàn)證了 OC-116定點(diǎn)突變獲得 Kozak序列(1.77倍和4.13倍)的pcDNA3.1/myc-His(-) A載體(1.42倍和3.43倍)的重組質(zhì)粒比野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力高,同時(shí)利用 Western blotting方法通過灰度分析鑒定了上述載體的翻譯表達(dá)能力比野生型高

3、。
　　2)使用pcDNA3.1/myc-His(-)A、OC116(M1)-pcDNA和OC116(M1-5)-pcDNA三種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染了子宮內(nèi)皮細(xì)胞,獲得cDNA、總蛋白后,利用Western blotting方法檢測(cè)到糖胺聚糖的存在,從而鑒定了雞OC-116編碼基因真核表達(dá)重組子在雞細(xì)胞中的糖胺聚糖修飾作用,通過Real-time PCR方法從轉(zhuǎn)錄水平初步篩選出了Chondroitin synthase、ChPF、DS