重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人核心蛋白聚糖基因逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的研究.pdf

1、研究背景和目的：纖維增生性疾病是導(dǎo)致死亡率和發(fā)病率升高的一個(gè)重要因素，同時(shí)它也影響著所有組織，器官和系統(tǒng)的功能。然而，盡管此類疾病給人們的健康造成極大的威脅，目前卻沒有有效的能針對(duì)纖維化發(fā)生機(jī)制的治療方式。纖維化通常被定義為機(jī)體對(duì)于創(chuàng)傷-愈合反應(yīng)失調(diào)控，是心臟及其它組織對(duì)于損傷的一種反應(yīng)性應(yīng)答。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種成纖維細(xì)胞趨化因子，可以刺激成纖維細(xì)胞增殖，增加細(xì)

2、胞外基質(zhì)蛋白（包括膠原）的合成。大量研究證明TGF-β在心肌纖維化的病因及進(jìn)展中扮演重要角色。因此我們希望能找到可以阻斷TGF-β生物學(xué)活性的一種特異性物質(zhì)，而人核心蛋白聚糖(decorin，DCN)正是這樣一種物質(zhì)。DCN屬于小蛋白聚糖家族中的一員，其特點(diǎn)是核心蛋白富含亮氨酸的重復(fù)單位。人核心蛋白聚糖被認(rèn)為是TGF-β的一種天然的拮抗因子。大量實(shí)驗(yàn)證明DCN不僅能結(jié)合TGF-β，而且可以通過對(duì)TGF-β的生物學(xué)活性進(jìn)行中和而抑制因TG

3、F-β過度表達(dá)而引發(fā)的各個(gè)器官纖維化。隨著對(duì)DCN功能和組成結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，表明DCN在因過度表達(dá)TGF-β而導(dǎo)致的器官纖維化的防治中有著廣泛的應(yīng)用前景。因此我們推測DCN可能為高血壓所致的心血管系統(tǒng)器官纖維化的治療研究提供新的靶點(diǎn)。近年來，重組腺相關(guān)病毒載體(recombinant adeno-associated virus，rAAV)得到了廣泛的研究和關(guān)注。rAAV能轉(zhuǎn)染非分裂期和分裂期細(xì)胞，并且可以獲得較為穩(wěn)定，高效和長久的

4、表達(dá)?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，本研究克隆人DCN基因cDNA全長序列，測序鑒定正確后將其連接到重組腺相關(guān)病毒載體上，并在293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，且經(jīng)過斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)測定其滴度，最終收獲能夠滿足我們實(shí)驗(yàn)所需要的高滴度的重組腺相關(guān)病毒DCN (rAAV-DCN)。然后經(jīng)大鼠尾靜脈轉(zhuǎn)染到老年自發(fā)性高血壓大鼠纖維化模型中，觀察重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的DCN基因?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的治療作用及進(jìn)一步對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 方法：將人類

5、DCN基因?qū)胫亟M腺相關(guān)病毒載體中，并在293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，且經(jīng)過斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)測定其滴度，最終收獲能夠滿足我們實(shí)驗(yàn)所需要的高滴度的重組腺相關(guān)病毒DCN (rAAV-DCN)。然后以已經(jīng)發(fā)生心肌纖維化的四個(gè)月月齡的自發(fā)性高血壓大鼠為模型，分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1ml，rAAV-GFP和rAAV-DCN病毒（1′1011pfu/只，每組7只），在實(shí)驗(yàn)前及導(dǎo)入病毒后每2周監(jiān)測一次動(dòng)脈收縮壓并收集一次24小時(shí)尿，共持續(xù)4個(gè)月。處死動(dòng)物前

6、經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管入左心室，用美國PowerLab公司提供的心功能測定儀測定大鼠心功能的各項(xiàng)指標(biāo)。處死動(dòng)物之后提取動(dòng)物心、主動(dòng)脈、肝、腎等組織并置入-80℃冰箱中保存，然后提取上述組織中的總RNA和蛋白質(zhì)。接著分別用RT-PCR，Western blot和ELISA方法檢測DCN mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)和分布情況；檢測不同時(shí)間段尿中微量白蛋白的含量及變化；全心及左心室稱重以了解心室重構(gòu)情況；腎臟，心臟石蠟包埋后用膠原染色并進(jìn)行定量分析以觀

7、察腎臟和心臟纖維化情況。同時(shí)用Western blot檢測TGF-β、α-SMA、p-smad2、p38MAPK和p-Akt等信號(hào)途徑。
　　 結(jié)果：1.心功能分析檢測表明，導(dǎo)入DCN基因后可使心功能得到明顯的改善，rAAV-DCN組大鼠左室收縮末壓(LVESP)，左室等容收縮壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左室等容舒張壓最大下降速率(-dp/dtmax)的絕對(duì)值較對(duì)照組和GFP組顯著增加，而左室舒張末壓(LVEDP)顯著

8、降低；2.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入rAAV-DCN病毒后，在心臟、肝臟和腎臟中DCN基因均有顯著的表達(dá)，同時(shí)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入rAAV-DCN病毒后，在心臟、肝臟、腎臟和血管中均有DCN基因顯著表達(dá)，除此之外，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了rAAV-DCN病毒的動(dòng)物從第2周開始直到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（16周），其血漿中的DCN水平均有較高且穩(wěn)定的表達(dá)，且其表達(dá)水平要顯著高于對(duì)照組；3.心臟切片的膠原染色分析結(jié)果顯示：用天狼星紅染色法對(duì)

9、心肌進(jìn)行膠原染色后可見對(duì)照組及GFP組心肌細(xì)胞肥大，心肌排列紊亂且可見大量膠原沉積，而導(dǎo)入了rAAV-DCN病毒的動(dòng)物其心肌結(jié)構(gòu)較為正常且僅見少量膠原沉積。這說明DCN可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)高血壓引起的心肌重構(gòu)；4. 心肌細(xì)胞直徑測量及左心室重量與心臟重量的比值也證實(shí)了以上結(jié)果；5. 導(dǎo)入DCN基因后的不同時(shí)間點(diǎn)，尿微量白蛋白的含量較對(duì)照組要明顯下降，且此種作用一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（16周）；6.腎臟天狼星紅染色表明：對(duì)照組及GFP組可見腎臟腎小

10、球纖維化程度明顯，血管壁增厚且有大量紅色膠原沉積。而DCN組較為正常，僅見少量紅色膠原沉積沉積。這表明DCN可預(yù)防或明顯改善老年高血壓大鼠的腎臟纖維化；7.Western blot結(jié)果顯示導(dǎo)入DCN基因后α-SMA的表達(dá)水平較對(duì)照組和GFP組顯著降低；8.Western blot結(jié)果顯示導(dǎo)入DCN基因后TGF-β、p-smad2、p38MAPK的表達(dá)水平較對(duì)照組和GFP組顯著降低，而Smad6及P308-Akt的表達(dá)水平較對(duì)照組和GFP