低劑量B(a)P暴露對小鼠肺臟microRNAs表達(dá)譜影響及生物學(xué)功能研究.pdf

1、苯并(a)芘[B(a)P]是一種常見的環(huán)境污染物，尤其在香煙的煙霧、工業(yè)及汽車廢氣中含量較多，因其致癌性而一直受到廣泛關(guān)注。它的致癌性強(qiáng)，且在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化比較典型，常常作為環(huán)境致癌研究的代表。
　　MicroRNAs(miRNAs)是新近發(fā)現(xiàn)的長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，能夠通過與靶mRNA特異性堿基配對引起其降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程，為近年來分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。越

2、來越多的研究表明miRNAs異常表達(dá)與人類許多疾病尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，對miRNAs進(jìn)行基因表達(dá)分析對腫瘤的分類、診斷和預(yù)后可能具有重要意義。外源性環(huán)境化合物是引起許多腫瘤發(fā)生的主要原因，因此miRNAs在機(jī)體對外源性環(huán)境化合物的反應(yīng)中也可能起著重要作用，但此方面的報道極少。
　　本研究以小鼠為研究對象，應(yīng)用高通量測序技術(shù)，從全基因組水平觀察長期低劑量B(a)P染毒后小鼠肺臟miRNAs表達(dá)譜的改變狀況，運(yùn)用RT-qPCR

3、對差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，并通過生物信息學(xué)分析軟件對差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因及調(diào)控通路分析，在此基礎(chǔ)上，對miR-20b的生物學(xué)功能及靶基因調(diào)控進(jìn)行研究，較為系統(tǒng)的探討miRNAs在低劑量長期B(a)P暴露過程中的作用及可能機(jī)制，為外源性環(huán)境化合物健康危害效應(yīng)提供可能的生物標(biāo)志。
　　一、低劑量長期B(a)P暴露小鼠肺臟miRNAs表達(dá)譜分析
　　將清潔級ICR小鼠隨機(jī)分為兩組，每組20只，雌雄各半。染毒組經(jīng)灌

4、胃途徑給予5μg/kg B(a)P，一周兩次，共染毒8周，對照組同時給予同等劑量的溶劑橄欖油。染毒結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)8周。飼養(yǎng)結(jié)束后股動脈放血處死小鼠，收集臟器。分別對染毒組和對照組小鼠肺臟利用Trizol法提取RNA，應(yīng)用SOLiD TM3高通量測序分析系統(tǒng)進(jìn)行全基因組miRNAs測序分析。測序結(jié)果顯示，與對照組相比，染毒組小鼠肺臟miRNAs表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，74個miRNAs表達(dá)差異在2倍以上，其中32個miRNAs表達(dá)明顯上調(diào)，4

5、2個miRNAs表達(dá)明顯下調(diào)，miRNAs整體下調(diào)的幅度高于上調(diào)的幅度。我們對上調(diào)明顯的miR-133a及下調(diào)明顯的miR-20b和miR-181a應(yīng)用TaqMan探針法進(jìn)行RT-qPCR分析，結(jié)果顯示：與對照組相比，染毒組小鼠肺組織miR-133a明顯上調(diào)，miR-20b和miR-181a明顯下調(diào)，RT-qPCR結(jié)果與測序結(jié)果吻合度高，測序結(jié)果可靠。
　　二、差異表達(dá)miRNAs生物信息學(xué)分析
　　利用權(quán)威的miRNAs分

6、子功能分析軟件DIANA-mirPath及KEGG數(shù)據(jù)庫，對第一章篩選出來的差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行信號通路分析，結(jié)果顯示，let-7d、let-7f、let-7i、miR-340，miR-27a、miR-106a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-429、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-130b、miR-301b等miRNAs對KEGG信號通路貢獻(xiàn)較大，差異表達(dá)miRNAs調(diào)控通路主要集

7、中在環(huán)境信息處理相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(MAPK、ErbB、Wnt、TGF-β、mTOR signaling pathway等)、細(xì)胞通訊及肺癌等多種腫瘤相關(guān)通路。對miR-20b信號通路分析結(jié)果顯示，其調(diào)控通路主要集中在環(huán)境信息處理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(TGF-β、MAPK、ErbB和mTORsignaling pathway)以及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤相關(guān)過程；應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件TargetScan，miRanda及picTar對miR-20b的靶基

8、因進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，miR-20b可能通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、周期、凋亡及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因參與調(diào)控B(a)P介導(dǎo)的致癌過程。
　　三、miR-20b對16HBE細(xì)胞的生物學(xué)功能及靶基因調(diào)控研究
　　通過轉(zhuǎn)染anti-miR-20b下調(diào)16HBE細(xì)胞中miR-20b的表達(dá)水平，應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測miR-20b表達(dá)改變對16HBE細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力

9、明顯增強(qiáng)，細(xì)胞周期G1期下降，S期上升，但細(xì)胞凋亡率無顯著性改變，說明下調(diào)miR-20b表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化。通過RF-qPCR和Western Blot技術(shù)分別對AKT3基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞AKT3基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均無顯著性改變，未發(fā)現(xiàn)miR-20b對AKT3具有明顯調(diào)控作用。
　　綜上所述，低劑量長期B(a)P暴露后小鼠miRN