血管性癡呆小鼠ERP和海馬神經元絲裂原活化蛋白激酶信號通路變化及鹽酸多奈哌齊的影響.pdf

1、血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由各種腦血管病引起的獲得性智能及認知功能損害綜合征，屬神經內科的常見病、多發(fā)病。 本實驗應用免疫組化技術、原位雜交技術對VD小鼠海馬細胞的ERK、JNK、p38 MAPK的表達進行測定，并將各組跳臺試驗、水迷宮試驗的學習、記憶成績與海馬細胞的ERK、JNK、p38 MAPK的表達進行相關性分析，結果證明了正常組、假手術組無論是學習、記憶成績或是MAPK信號轉導通路均與VD模

2、型組小鼠有顯著性差異，VD模型組小鼠學習、記憶功能減退，JNK，p38 MAPK增加，兩者成正相關，而ERK降低，成負相關，證明了MAPK信號轉導通路參與了小鼠的學習、記憶功能的機制。而多奈哌齊的應用可以通過減少JNK，p38 MAPK增加，增加ERK的表達改善VD小鼠學習、記憶功能。 本實驗的目的是進一步探討VD小鼠ERP的變化、MAPK家族在VD發(fā)病中的表達的變化及其機制，多奈哌齊對其影響。 一、VD小鼠模型的建立及

3、VD小鼠學習、記憶成績的測試 方法： 1.動物分組與模型制備：實驗動物選用3月齡雄性昆明小鼠306只，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2003-1-003，清潔級2級，體重(32.5±2.5)g，適應性飼養(yǎng)1周，然后將小鼠隨機分為正常對照組(n=78)、假手術組(n=77)、VD模型組(n=75)、多奈哌齊組(n=76)。采用頸總動脈線結反復缺血再灌注法制備模型，假手術組僅暴露雙側頸總動脈而不結扎，

4、且尾部不放血。多奈哌齊組為制備模型術后第2天，給予鹽酸多奈哌齊灌胃，劑量3mg·kg-1·d-1，每天1次。同時模型組、假手術組給予生理鹽水，劑量0.01ml·kg-1·d-1，每天1次。 2.學習、記憶成績測試：術后第29天，分別進行跳臺試驗和水迷宮試驗。測試跳臺試驗，反應時間(sec)和錯誤次數(number/5min)作為學習、記憶成績,水迷宮試驗游完全程時間(sec)和錯誤次數(number/3min)作為學習、記憶成績

5、。術后第30天，進行跳臺試驗和水迷宮試驗，測試跳臺試驗，潛伏時間和錯誤次數作為記憶成績，水迷宮試驗游完全程時間和錯誤次數作為記憶成績。 結論:本實驗采用頸總動脈線結反復缺血再灌注法成功地制備了小鼠VD模型,經跳臺試驗、水迷宮試驗證實了VD小鼠存在學習和記憶功能障礙,VD模型組小鼠學習階段的學習、記憶成績低于正常組、假手術組,記憶階段的記憶成績亦低于正常組、假手術組.多奈哌齊可改善學習階段、記憶階段的學習、記憶成績。 二、

6、VD小鼠ERP測定與評價及多奈哌齊的影響 方法: 1.動物分組與模型制備:將64例小鼠隨機分為正常對照組(n=16)、假手術組(n=16)、VD模型組(n=16)、多奈哌齊組(n=16).采用雙側頸總動脈線結反復缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺試驗和水迷宮試驗觀測其行為學改變。 2.ERP電位測定方法:將小鼠固定在立體定位儀(自制)上,剃除耳后、頭頂部及額部毛,75％酒精消毒皮膚,用0.5寸毫針刺入至矢狀縫

7、與兩外耳道連線交點頭皮下,斜向前約2～3mm,作為記錄電極；參考電極置于耳后下方；接地電極置于前額部.采用加拿大Xltek公司生產的肌電圖誘發(fā)電位測定儀,實驗采用短聲刺激,靶刺激頻率2000Hz,概率20％；非靶刺激頻率1000Hz,概率80％.刺激聲強120dB,分析時間500ms,疊加300次,并顯示N2潛伏期、P3潛伏期及波幅等,測定重復3次,取平均值。 結論: 建立了小鼠在非麻醉狀態(tài)下采取頭部皮下插入電極測定ERP的方法

8、,為動物的實驗研究提供了客觀的、無創(chuàng)性的、定量的、有價值的電生理檢測手段。證實VD模型組小鼠N2潛伏期、P3潛伏期明顯長于正常組、假手術對照組,P3波幅明顯低于正常組、假手術對照組。多奈哌齊組可減低小鼠的N2潛伏期、P3潛伏期,提高P3波幅。 三、VD小鼠海馬神經元JNK及其JNK mRNA的變化及多奈哌齊的影響 方法: 1.動物分組與模型制備:將87例小鼠隨機分為正常對照組(n=23)、假手術組(n=21)、V

9、D模型組(n=22)、多奈哌齊組(n=21).采用雙側頸總動脈線結反復缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺試驗和水迷宮試驗觀測其行為學改變。 2.JNK測定方法:小鼠以10％水合氯醛麻醉,經灌注固定其腦組織,海馬組織部位常規(guī)石蠟切片,應用免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)技術觀察海馬CA1區(qū)JNK陽性錐體細胞的形態(tài)和分布,計算各切片海馬CA1區(qū)JNK染色陽性錐體細胞相同面積數目,應用原位雜交(in

10、 situ hybridization,ISH)技術方法測定各組小鼠海馬CA1區(qū)JNK mRNA表達陽性錐體細胞的變化。 結論: VD小鼠學習、記憶成績下降可能與其海馬JNK陽性錐體細胞水平增加有關.JNK陽性錐體細胞的增加是血管性癡呆小鼠學習、記憶成績下降的分子學機制之一.多奈哌齊可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)JNK陽性錐體細胞水平的上升,促進其學習和記憶成績的改善。 四、VD小鼠海馬神經元ERK1及其ERK1mRNA的

11、變化及多奈哌齊的影響 方法: 1. 動物分組與模型制備:將91例小鼠隨機分為正常對照組(n=23)、假手術組(n=24)、VD模型組(n=21)、多奈哌齊組(n=23)).采用雙側頸總動脈線結反復缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺試驗和水迷宮試驗觀測其行為學改變。 2. ERK1測定方法:小鼠以10％水合氯醛麻醉,經灌注固定其腦組織,海馬組織部位常規(guī)石蠟切片,應用IHC技術觀察海馬CA1區(qū)ERK1陽性錐體細胞

12、的形態(tài)和分布,計算各切片海馬CA1區(qū)ERK1染色陽性錐體細胞面密度值,應用ISH技術方法測定各組小鼠海馬CA1區(qū)ERK1mRNA表達陽性細胞的變化。 結論: 證實了海馬組織ERK1的減少與血管性癡呆小鼠學習、記憶成績下降有關,多奈哌齊可以通過促進海馬ERK1水平的上升,改善VD的學習、記憶成績。 五、VD小鼠海馬神經元p38 MAPK及其p38 MAPK mRNA的變化及多奈哌齊的影響 方法: 1.動物分

13、組與模型制備:將64例小鼠隨機分為正常對照組(n=16)、假手術組(n=16)、VD模型組(n=16)、多奈哌齊組(n=16).采用雙側頸總動脈線結反復缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺試驗和水迷宮試驗觀測其行為學改變。 2.p38 MAPK測定:小鼠以10％水合氯醛麻醉,經灌注固定其腦組織,海馬組織部位常規(guī)石蠟切片,應用IHC技術觀察海馬CA1區(qū)p38 MAPK陽性錐體細胞的形態(tài)和分布,計算各切片海馬CA1區(qū)p38 MAP