克羅恩病與腸結(jié)核病理組織中膠原纖維差異性研究.pdf

1、克羅恩病(Crohn's disease，CD)是一種病因復(fù)雜、發(fā)病機(jī)制尚未明確的慢性非特異性炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)。目前該病診斷仍缺乏特異性方法。CD是歐洲和北美國(guó)家常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，而在發(fā)展中國(guó)家相對(duì)少見(jiàn)。但隨著我國(guó)工業(yè)化、城市化進(jìn)程加快，CD的發(fā)病率不斷升高。腸結(jié)核(Intestinal tuberculosis，ITB)是結(jié)核分枝桿菌侵犯腸道引起的慢性特異性感染性疾病，是最常

2、見(jiàn)的肺外結(jié)核病之一，其臨床表現(xiàn)呈多樣性，少數(shù)病例確診困難。二者在臨床表現(xiàn)上均可有不規(guī)則發(fā)熱、腹痛、腹瀉、便血及腹塊，當(dāng)病變?cè)缙诰窒抻诨孛げ繒r(shí)，影像學(xué)表現(xiàn)及內(nèi)鏡下所見(jiàn)相似，甚至活檢亦難以鑒別。有報(bào)道指出2種疾病相互誤診率高達(dá)50％～70％。由于CD和ITB的病因、治療方法及預(yù)后均不同，因此，當(dāng)ITB誤診為CD而使用激素或免疫抑制劑治療時(shí)可導(dǎo)致結(jié)核病灶擴(kuò)散;而當(dāng)CD誤診為ITB使患者承受不必要的抗結(jié)核藥物的毒副作用，延誤CD的治療可能導(dǎo)致一

3、些本可避免的并發(fā)癥的發(fā)生。因此，治療前二者的鑒別診斷十分必要。
　　 在我國(guó)2007年炎癥性腸病(IBD)診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)中，關(guān)于克羅恩病與腸結(jié)核鑒別的意見(jiàn)，當(dāng)患者存在肛周病變、腸瘺、腸外表現(xiàn)、腹腔膿腫或便血等并發(fā)癥、病變切除術(shù)后復(fù)發(fā)等特征之一或多種更多地考慮克羅恩病;而當(dāng)患者存在活動(dòng)性腸外結(jié)核或者活檢見(jiàn)干酪性壞死肉芽腫才能有把握診斷腸結(jié)核。而目前國(guó)內(nèi)外消化科醫(yī)師主要通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)檢查指標(biāo)的量化、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，來(lái)鑒別兩者。聯(lián)合臨床

4、表現(xiàn)、內(nèi)鏡特征、組織病理學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行探討鑒別CD和腸結(jié)核的指標(biāo)和方法，尋找預(yù)測(cè)鑒別CD和ITB的指標(biāo)，旨在提高診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。但這只是臨床綜合推理和概率診斷，只有明確病因或發(fā)病機(jī)制才可能最終解決難于鑒別的難題。CD和ITB最關(guān)鍵的不同是病因的不同，因此鑒別的關(guān)鍵是找到結(jié)核桿菌。然而，傳統(tǒng)的抗酸染色鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率極低，故價(jià)值不大。PCR技術(shù)的產(chǎn)生為兩者鑒別提供了一種新方法，有研究發(fā)現(xiàn)在有肉芽腫而未發(fā)現(xiàn)干酪樣壞死灶的腸結(jié)核

5、活檢組織中，PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌DNA的陽(yáng)性率達(dá)71.4％，而同樣形態(tài)的CD活檢組織中無(wú)1例陽(yáng)性。在一些僅見(jiàn)肉芽腫而找不到干酪樣壞死灶的腸結(jié)核病例中，PCR技術(shù)對(duì)ITB和CD的鑒別診斷非常有價(jià)值。但PCR技術(shù)操作過(guò)程復(fù)雜，技術(shù)要求較高，操作過(guò)程中需嚴(yán)密防止“RNA酶”的污染，且引物設(shè)計(jì)的特異性選擇同樣也非常復(fù)雜，難以在臨床上大規(guī)模應(yīng)用。因此迫使我們積極尋找CD和ITB鑒別的更簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可行、更適合臨床應(yīng)用的方法。
　　 在克

6、羅恩病和腸結(jié)核病變中，由于腸道組織對(duì)腸道慢性炎癥過(guò)度刺激、不可逆應(yīng)答形成了腸組織纖維化。病理表現(xiàn)為腸道肌層的過(guò)度生長(zhǎng)，膠原組織的過(guò)度沉積，間質(zhì)細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。腸道受損時(shí)，固有層上皮下肌樣成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口的愈合，促進(jìn)膠原的大量分泌以及細(xì)胞的增殖。膠原的過(guò)度沉積、間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生會(huì)導(dǎo)致腸纖維化的發(fā)生。因此本研究擬比較克羅恩病和腸結(jié)核病變中腸道組織纖維化的特點(diǎn)，探索一種新的克羅恩病和腸結(jié)核的鑒別診斷方法。這將有助于克羅恩病和腸結(jié)核的鑒別診斷

7、，并為進(jìn)一步的臨床治療打下基礎(chǔ)。但是腸道組織纖維化的評(píng)估卻是一個(gè)難題，即使是目前公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”腸道組織病理活檢也有其局限性。傳統(tǒng)病理對(duì)組織纖維化的判讀是基于膠原纖維特殊性染色方法和病理醫(yī)生的人為評(píng)估，客觀性和重復(fù)性差。
　　 近年來(lái)非線性光學(xué)技術(shù)為研究組織內(nèi)膠原纖維提供了全新的手段，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中。二次諧波（second harmonic generation，SHG）顯微成像技術(shù)最適合對(duì)非中心對(duì)稱的分子進(jìn)行成像，幾

8、乎所有類型的膠原纖維都能產(chǎn)生SHG信號(hào)，能特異性的顯示膠原纖維及其三維形態(tài);雙光子激發(fā)熒光(two-photonexcited fluorescence，TPEF)則能顯示細(xì)胞基質(zhì)結(jié)構(gòu)及膠原纖維沉積位置。1986年，F(xiàn)reund等首次將SHG用于老鼠尾腱的膠原纖維成像，其后，用于包括角膜、鼠尾肌腱和牛(I)型Achilles腱、人皮膚，還用于小鼠腎臟纖維化模型、大鼠肝臟纖維化模型、人肝纖維化研究，以及通過(guò)觀察不同的膠原結(jié)構(gòu)來(lái)鑒別良惡性腫

9、瘤、腫瘤復(fù)發(fā)的早期診斷等。SHG獲得的圖像可由計(jì)算機(jī)處理、準(zhǔn)確判讀組織纖維化的程度。研究中還發(fā)現(xiàn):不同因素導(dǎo)致的纖維化，纖維膠原的三維結(jié)構(gòu)、沉積方式差異明顯，通過(guò)纖維膠原三維結(jié)構(gòu)來(lái)推斷病因是一個(gè)值得探索的診斷途徑。Jianxin Chen等運(yùn)用SHG/TPEF技術(shù)觀察正常胃和胃癌粘膜及粘膜下組織的特點(diǎn)，以期利用此項(xiàng)技術(shù)來(lái)提高胃癌的早期確診率。但目前尚未有報(bào)道將該技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)結(jié)腸病變纖維化特點(diǎn)。
　　 國(guó)內(nèi)外的研究顯示，通過(guò)SH

10、G/TPEF顯微成像技術(shù)可以特異性顯示組織中纖維性沉積的膠原蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)非染色肝、腎組織纖維化的自動(dòng)化評(píng)估，SHG/TPEF顯微成像技術(shù)能夠顯示纖維素沉積的三維結(jié)構(gòu)，可用來(lái)推測(cè)纖維化的病因。本研究通過(guò)對(duì)克羅恩病和腸結(jié)核臨床病例的臨床特點(diǎn)、內(nèi)鏡檢查及病理標(biāo)本回顧研究，總結(jié)兩者不同的特征，尋找預(yù)測(cè)鑒別CD和ITB的指標(biāo)，旨在提高診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。并通過(guò)應(yīng)用傳統(tǒng)病理技術(shù)（Masson's三染色）和SHG/TPEF顯微成像技術(shù)，觀察

11、克羅恩病與腸結(jié)核纖維素沉積的特征，為兩者的鑒別診斷探索一種新的方法。
　　 第一部分克羅恩病與腸結(jié)核臨床、內(nèi)鏡及病理的對(duì)比分析
　　 目的:對(duì)比分析克羅恩病與腸結(jié)核的臨床、內(nèi)鏡及病理特征，以期尋找預(yù)測(cè)鑒別CD和ITB的指標(biāo)，提高兩者診斷的準(zhǔn)確率。
　　 材料和方法:采用回顧性方法，查找我院2006年至2012年確診為克羅恩病、腸結(jié)核的病例資料，其中克羅恩病39例，腸結(jié)核34例?？肆_恩病組:男性23例，女性13例，

12、平均年齡:39.13±18.39歲;腸結(jié)核組:男性20例，女性14例，平均年齡:36.62±14.09歲。分別收集兩組病例資料(1)一般資料:姓名、性別、年齡、地區(qū)（農(nóng)村、城市）;(2)臨床癥狀:腹痛、腹瀉、便秘、血便、發(fā)熱、盜汗、消瘦、腹水;(3)合并并發(fā)癥:腸腔狹窄、腸梗阻、瘺管形成、腸外結(jié)核;(4)實(shí)驗(yàn)檢查:血紅蛋白、血沉、白蛋白、PPD試驗(yàn);(5)內(nèi)鏡表現(xiàn):粘膜充血水腫、糜爛、潰瘍、縱形潰瘍、環(huán)形潰瘍、鵝卵石征、節(jié)段性改變、腸腔

13、狹窄、假性息肉、粘膜橋、回盲瓣受累;(6)病理組織學(xué):炎癥、肉芽腫形成、干酪樣肉芽腫、非干酪樣肉芽腫、裂隙狀潰瘍、腺體增生。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，對(duì)克羅恩病和腸結(jié)核兩組的病例資料進(jìn)行比較，記數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1)發(fā)病地區(qū):克羅恩病集中在城市(61.5％)，腸結(jié)核好發(fā)于農(nóng)村地區(qū)(64.7％)，P=0.025。(2)臨床癥狀:血便克羅恩病組(

14、17.9％，P=0.041)多見(jiàn)，出現(xiàn)盜汗（克羅恩病組7.7％（腸結(jié)核組29.4％，P=0.016）、腹水（克羅恩病組7.7％（腸結(jié)核組29.4％，P=0.016）支持診斷腸結(jié)核，腹痛(P=0.562)、腹瀉(P=0.743)、便秘(P=0.380)、發(fā)熱(P=0.244)、消瘦(P=0.541)在兩組比較中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)合并并發(fā)癥:瘺管形成（克羅恩病組17.9％）腸結(jié)核組2.9％，P=0.041)支持診斷克羅恩病，腸外結(jié)核(克

15、羅恩病組2.6％(腸結(jié)核組58.8％，P=0.000)支持診斷腸結(jié)核診斷，而腸腔狹窄(P=0.719)、腸梗阻(P=0.208)在兩組比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)實(shí)驗(yàn)檢查:血紅蛋白（克羅恩病組108.46±19.01g/L（腸結(jié)核組111.81±19.17 g/L，P=0.458）、血沉（克羅恩病組37.71±19.98 mm/h）腸結(jié)核組31.91±17.45mm/h，P=0.194）、白蛋白（克羅恩病組33.47±7.87g/L）腸結(jié)

16、核組31.91±17.45g/L，P=0.282）兩組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)內(nèi)鏡表現(xiàn):內(nèi)鏡下見(jiàn)縱形潰瘍（克羅恩病組33.3％，腸結(jié)核組6.5％，P=0.008）、節(jié)段性改變（克羅恩病組48.5％，腸結(jié)核組9.7％，P=0.001）、假性息肉（克羅恩病組48.5％，腸結(jié)核組16.1％，P=0.006）及粘膜橋（克羅恩病組21.2％，腸結(jié)核組3.2％，P=0.030）較支持克羅恩病診斷，鵝卵石征（克羅恩病組21.2％，腸結(jié)核組0％，P

17、=0.007）僅見(jiàn)于克羅恩病;環(huán)形潰瘍（克羅恩病組12.1％，腸結(jié)核組41.9％，P=0.007）及回盲瓣受累（克羅恩病組51.5％，腸結(jié)核組77.4％，P=0.031）較支持腸結(jié)核診斷;粘膜充血水腫(P=0.854)、糜爛(P=0.955)、潰瘍(P=0.894)、腸腔狹窄(P=0.362)兩組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(6)病理組織學(xué):裂隙樣潰瘍(14.3％，P=0.022)僅見(jiàn)于克羅恩病，干酪樣肉芽腫(17.6％，P=0.009)僅見(jiàn)

18、于腸結(jié)核，兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。炎癥(P=0.307)、肉芽腫形成(P=0.113)、非干酪樣肉芽腫(P=0.733)、腺體增生(P=0.082)、肉芽組織形成(P=0.463)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:克羅恩病與腸結(jié)核在臨床癥狀、內(nèi)鏡及病理組織表現(xiàn)上非常相似，易誤診。鵝卵石征、裂隙狀潰瘍是克羅恩特征性表現(xiàn)，干酪樣肉芽腫僅見(jiàn)于腸結(jié)核，但它們的出現(xiàn)率均較低，因此，單純依靠?jī)?nèi)鏡及病理組織鑒別兩者，價(jià)值有限，仍需結(jié)合臨床癥狀、實(shí)

19、驗(yàn)室檢查等綜合判斷。
　　 第二部分克羅恩病與腸結(jié)核病理組織中膠原纖維差異性分析
　　 目的:通過(guò)臨床癥狀、內(nèi)鏡及病理組織的表現(xiàn)鑒別克羅恩病及腸結(jié)核仍存在較大的困難。不同病因?qū)е碌慕M織纖維性膠原三維結(jié)構(gòu)差異明顯。擬通過(guò)應(yīng)用傳統(tǒng)病理技術(shù)（Masson's三染色）和SHG/TPEF顯微成像技術(shù)，觀察克羅恩病與腸結(jié)核膠原纖維沉積的特征，為兩者的鑒別診斷探索一種新的方法。
　　 材料和方法:選取我院確診克羅恩病病理標(biāo)本2

20、9例（內(nèi)鏡活檢標(biāo)本25例，手術(shù)標(biāo)本4例），腸結(jié)核組病理標(biāo)本14例（內(nèi)鏡活檢組織12例，手術(shù)標(biāo)本2例），健康對(duì)照組腸鏡鏡活檢標(biāo)本（取回盲部）11例。每份病理標(biāo)本均連續(xù)切片3張，分別行HE染色、Masson's三染色、SHG/TPEF成像。采用Image-Pro Plus6.0軟件分析Masson's三染色圖片，計(jì)算平均吸光度(Average optical density, AOD)，平均吸光度=積分吸光度/（總面積一空白面積），以AOD

21、來(lái)反映膠原纖維表達(dá)水平;測(cè)量積分面積(Area)，計(jì)算平均面積(Average area，Area)，平均面積=積分面積/(總面積-空白面積），以Area來(lái)反映膠原纖維沉積面積。觀察SHG/TPEF成像圖片膠原纖維沉積特點(diǎn)。運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較，方差齊采用LSD-t法多重比較，若方差不齊，采用Dunnett's T3多重比較。對(duì)克羅恩病和腸結(jié)核兩組組間

22、進(jìn)行比較，小樣本采用Fisher精確概率法，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1) Masson's三染色:在CD組、ITB組及健康對(duì)照組中，ITB組膠原纖維表達(dá)量最高（平均吸光度=560.1772±230.6484），膠原纖維沉積面積最大（1116.115±410.5037）。CD組、ITB組膠原纖維量及膠原沉積面積均高于健康對(duì)照組，且P均＜0.05。但CD組與ITB組比較，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)

23、計(jì)學(xué)差異。在剔除手術(shù)標(biāo)本后，ITB組膠原纖維表達(dá)量及膠原面積均高于CD組，兩組問(wèn)比較，P＜0.05。在內(nèi)鏡活檢標(biāo)本中，有肉芽腫的標(biāo)本中膠原纖維表達(dá)量（430.2869±187.6046）高于無(wú)肉芽腫（273.6598±243.2126）的標(biāo)本，且兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);有肉芽腫的膠原纖維面積（902.1117±379.9651）也明顯大于無(wú)肉芽腫（557.4849±380.6856）的標(biāo)本，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.0

24、5)。(2)SHG/TPEF成像:CD組與ITB組手術(shù)標(biāo)本中均可見(jiàn)大量膠原纖維沉積在粘膜下層，其中CD組膠原纖維多呈簇狀、卷發(fā)樣分布，無(wú)明顯規(guī)律;而ITB組可見(jiàn)膠原纖維在干酪樣肉芽腫周圍環(huán)形分布。兩者在腸鏡組織標(biāo)本中，可發(fā)現(xiàn)膠原纖維在腺體周圍散在分布。
　　 結(jié)論:在內(nèi)鏡活檢標(biāo)本中，腸結(jié)核膠原纖維表達(dá)量高于克羅恩病，有可能成為鑒別兩者的新依據(jù)。肉芽腫的存在與腸纖維化存在相關(guān)關(guān)系。在腸鏡活檢標(biāo)本中，腸結(jié)核肉芽腫檢出率高于克羅恩病，