體外連續(xù)培養(yǎng)人牙髓干細胞干性特征改變的相關研究.pdf

1、牙髓干細胞（Dental pulp stem cell，DPSCs）是成體干細胞（Adult-derived stem celsl,ASCs）家族的重要成員之一，起源于神經嵴來源的間充質細胞[1]，是從牙髓組織中提取分離出來的少量具有干細胞特性的未分化細胞。特定誘導條件下可定向分化為骨、軟骨、脂肪、神經、肝、心肌等多種組織細胞[2]。因其具有較骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMM

2、SCs）更高的分化程度，以及取材簡單，創(chuàng)傷小，來源廣泛，較強的分化潛能和自我更新能力[3]，目前被認為是組織工程學理想的種子細胞。但原代培養(yǎng)獲得人牙髓干細胞數量有限，須經體外擴增才能獲得足夠的種子細胞，而已有研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下會出現(xiàn)不同程度的衰老，有關牙髓干細胞體外連續(xù)傳代后生物學活性的改變尚不明確。
　　研究目的：本研究旨在通過觀察牙髓干細胞在體外連續(xù)傳代后細胞增殖、分化和自我更新能力等的變化，以探究體外培養(yǎng)環(huán)

3、境對牙髓干細胞干性的影響，為研究干細胞干性維持機制以及指導牙髓干細胞組織工程學臨床應用提供一定理論依據。
　　實驗方法和結果如下：
　　1.人牙髓干細胞（Human Dental Pulp Stem Cells，HDPSCs）分離、培養(yǎng)、純化和鑒定
　　采用I型膠原酶消化結合組織塊貼壁法分離獲得人原代牙髓細胞（Human Dental Pulp Cells，HDPCs）,有限稀釋法挑選單克隆純化牙髓細胞；流式細胞儀檢測

4、表明細胞高表達CD29、CD90、CD105、CD146和Stro-1表面標記分子，但CD34、CD45表達陰性，說明所獲細胞來源于間充質；茜素紅染色、ALP染色和油紅O染色陽性結果證實細胞具有向成牙本質/成骨細胞以及成脂細胞分化能力，實驗結果表明已成功培養(yǎng)獲得hDPSC。
　　2.連續(xù)傳代對hDPSCs形態(tài)、細胞表型以及衰老的影響
　　體外二維條件培養(yǎng)hDPSCs并連續(xù)傳代，分別以P4、P8、P12、P16、P20 hDP

5、SCs為研究對象，結果顯示：(1)P4 hDPSCs形小、呈圓形，隨著代數的增加，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，體積變大。（2）流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)各代hDPSCs表面標記物CD29、CD90表達無明顯差異（P>0.05），而與間充質干細胞密切相關的 CD105、CD146表達隨代數增加逐漸降低（P<0.05）。（3）SA-β-半乳糖苷酶染色顯示 P4 hDPSCs無明顯的衰老現(xiàn)象，但P16、P20衰老細胞比例顯著上調（P<0.01）。

6、　　3.體外連續(xù)培養(yǎng)hDPSCs增殖、分化以及克隆形成能力的影響
　?。?）MTT檢測結果顯示P4 hDPSCs增殖最快，隨后增殖能力逐代降低（P<0.05）。細胞周期結果顯示各代S期細胞所占總細胞數比例隨代數增加呈現(xiàn)降低趨勢。（2）分化能力檢測發(fā)現(xiàn)體外誘導各代 hDPSCs成牙本質/成骨細胞向分化14天，茜素紅著色隨代數的增加逐漸變淺，鏡下觀礦化結節(jié)數減少，Real-time PCR檢測顯示成牙本質細胞分化標記蛋白 DSPP,R

7、UNX2 mRNA表達水平隨代數的增加而降低（P<0.05）。體外誘導hDPSCs成脂向分化30天，油紅O染色結果顯示脂滴形成數隨代數的增加而減少，Real-Time PCR檢測PPAR-γ隨代數的增加而降低（P<0.05）。（3）甲苯胺藍染成纖維細胞集落形成率（Colony forming unit fibroblastic，CFU-F）實驗顯示隨代數的增加，克隆結節(jié)形成數目逐漸減少，表明 hDPSCs隨體外傳代次數的增加克隆形成能力

8、降低，自我更新能力減弱。（4）RT-PCR檢測各代 hDPSCs內生長因子IGF-2、TGF-β、HGF、FGF-2、VEGF、EGF、FGF-4、IL-6表達情況，結果顯示FGF、TGF-β隨代數增加表達減少，IGF-2、HGF、VEGF表達在P8 hDPSCs時顯著增強，HGF在P20 hDPSCs中出現(xiàn)一過性的高表達，hDPSCs不表達EGF、FGF-4、IL-6。
　　4.連續(xù)傳代對干性相關因子表達的影響
　　(1)

9、 Real-time PCR檢測各代hDPSCs Oct4可變剪接體（Oct4A，Oct4B）以及干性分子(Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog）表達改變，結果發(fā)現(xiàn)剪接體Oct4A和干性分子（Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog）在hDPSCs中表達，Oct4A表達量隨代數增加無明顯變化（P＞0.05），而c-Myc表達顯著上調后又逐漸下調，干性基因Sox2，Klf4和Nanog表達隨代數增加呈降低趨勢（P＜0.05），但各

10、代hDPSCs剪接體Oct4B表達均為陰性。
　　(2)激光共聚焦顯微鏡觀察連續(xù)傳代Oct4A定位改變，發(fā)現(xiàn)P4、P8 hDPSC中，Oct4A主要表達于細胞核，P12 hDPSCs中Oct4A表達逐漸從胞核向胞漿轉位。P16、P20 hDPSCs中Oct4A表達主要定位于胞漿，提示Oct4A轉位可能與干細胞干性的減弱有關。
　　綜上所述，本研究初步證明hDPSCs在體外擴增培養(yǎng)過程中其增殖、成牙本質/成骨向分化能力、自我更

11、新能力等干性特征逐漸減弱，進一步研究發(fā)現(xiàn)，干性相關分子中Sox2、Klf4和Nanog表達隨代數增加呈降低趨勢，而Oct4可變剪接體Oct4A表達量隨代數增加雖無明顯改變但出現(xiàn)胞核向胞漿轉位，提示可能干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A可能在hDPSCs干性維持中發(fā)揮著至關重要的作用，本課題今后進一步的研究將集中探討干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A轉位改變的功能作用，以期尋找到維持hDPSCs干性的的