促甲狀腺激素對(duì)脂肪細(xì)胞IRS-1的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:脂肪組織既是能量?jī)?chǔ)存的中心，又具有強(qiáng)大的內(nèi)分泌功能，它以旁分泌、自分泌和遠(yuǎn)距分泌的形式釋放多種不同生物活性的脂肪細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6（IL-6）、瘦素、脂聯(lián)素等，參與胰島素抵抗的發(fā)生。近年來(lái)，隨著胰島素抵抗病因?qū)W研究的不斷深入，促甲狀腺激素(TSH)與胰島素抵抗的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。已有研究證實(shí)，TSH受體(TSHR)不僅存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞表面，同樣存在于脂肪細(xì)胞表面。TSH與3T3-L1脂肪細(xì)胞表

2、面TSHR結(jié)合，通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶A(cAMP-PKA)通路分泌TNF-α。然而升高的TNF-α，是否進(jìn)而下調(diào)胰島素受體底物1(IRS-1)蛋白表達(dá)及干擾其正常酪氨酸磷酸化，參與胰島素抵抗的發(fā)生，尚不清楚。故本研究擬探討TSH是否會(huì)通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞TNF-α的分泌，進(jìn)而影響IRS-1蛋白表達(dá)及其酪氨酸磷酸化，參與脂肪組織胰島素抵抗的發(fā)生及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法:體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞為成熟脂肪細(xì)胞。

3、
　　1.分別以不同濃度牛TSH(0.01mIU/ml、0.1mI U/ml、1mIU/ml)刺激成熟脂肪細(xì)胞，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基TNF-α的水平、電泳遷移率變動(dòng)分析法檢測(cè)NF-κB活性、western blotting方法檢測(cè)IRS-1蛋白表達(dá)的變化、免疫沉淀法檢測(cè)IRS-1酪氨酸磷酸化水平;
　　2.給予5μMNF-κB核轉(zhuǎn)位抑制劑（BAY11-7082）預(yù)處理15分鐘，再予1mIU/ml牛血清TSH刺激成熟脂

4、肪細(xì)胞，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基TNF-α的水平、電泳遷移率變動(dòng)分析法檢測(cè)NF-κB活性、western blotting方法檢測(cè)IRS-1蛋白表達(dá)的變化、免疫沉淀法檢測(cè)IRS-1酪氨酸磷酸化水平;
　　3.給予10μM蛋白激酶A抑制劑(H89)預(yù)處理15分鐘，再予1mIU/ml牛血清TSH刺激成熟脂肪細(xì)胞，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基TNF-α的水平、電泳遷移率變動(dòng)分析法檢測(cè)NF-κB活性、western blotting方

5、法檢測(cè)IRS-1蛋白表達(dá)的變化、免疫沉淀法檢測(cè)IRS-1酪氨酸磷酸化水平;
　　4.給予10μM TNF-α拮抗劑(WP9QY)預(yù)處理15分鐘后，再予1mIU/ml牛血清TSH刺激成熟脂肪細(xì)胞，western blotting方法檢測(cè)IRS-1蛋白表達(dá)的變化、免疫沉淀法檢測(cè)IRS-1酪氨酸磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞在換用含有誘導(dǎo)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基至第10天后，誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞。
　　2

6、.電泳遷移率變動(dòng)分析結(jié)果顯示，TSH激活NF-κB，在凝膠電泳圖上可看到隨著TSH刺激濃度的增加，NF-κB/DNA探針結(jié)合條帶逐漸增強(qiáng)，當(dāng)加入H89后，條帶明顯減弱，提示TSH使NF-κB活性增強(qiáng)是通過(guò)蛋白激酶A通路實(shí)現(xiàn)的。
　　3.與空白對(duì)照組相比，隨著TSH刺激濃度的增加，培養(yǎng)基中TNF-α水平呈上升趨勢(shì)(P＜0.05)。而H89和BAY11-7082均可抑制TSH對(duì)TNF-α分泌的促進(jìn)作用。
　　4.IRS-1蛋白表