促甲狀腺激素對促動脈粥樣硬化因子的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:亞臨床甲減(SCH)被定義為血清TSH水平高于正常范圍并且血清甲狀腺激素(游離T3(FT3)以及游離T4(FT4))水平在正常范圍內(nèi)，在近年來受到了越來越多的關(guān)注。在成年人中亞臨床甲減的患病率為4％-20％。許多流行病學(xué)研究已經(jīng)證明了亞臨床甲減是動脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，并且與頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)的增加以及血脂異常相關(guān)。骨橋蛋白(OPN)是一種最初在骨中被發(fā)現(xiàn)的磷酸化糖蛋白，近年來有研究證明其在動脈粥樣硬化的病理發(fā)生過程

2、中發(fā)揮了重要作用。大量研究報(bào)道OPN在人動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)增多并且與冠狀動脈疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。整合蛋白αvβ3(Integrinαvβ3)是一種粘附分子受體，已有研究表明相比于正常血管，無論是非動脈粥樣硬化性的內(nèi)皮浸潤性增厚還是動脈粥樣硬化斑塊組織，其中Integrinαvβ3的表達(dá)水平均增加，可見Integrinαvβ3在動脈粥樣硬化病理過程中也起到了關(guān)鍵作用。血管細(xì)胞間粘附分子(V CAM-1)是一種經(jīng)典的粘附分子，可以介導(dǎo)單

3、核細(xì)胞和血管壁的相互作用，在內(nèi)皮的炎性反應(yīng)過程中扮演了重要角色。有研究表明人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HACE)以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中存在TSH受體(TSHR)的表達(dá)。在臨床研究中，關(guān)于TSH對血管內(nèi)皮功能的影響尚存在一定爭議。有的研究發(fā)現(xiàn)快速注射人重組促甲狀腺激素(rhTSH)可以引起快速的內(nèi)皮介導(dǎo)的血管舒張，而另外一些研究卻得到了與此相反的結(jié)論。關(guān)于TSH與不同血管內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究目前較少，相關(guān)結(jié)果尚無定論。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TSH作

4、用于人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，可以介導(dǎo)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和一氧化氮(NO)的表達(dá)增加，同時降低血管收縮因子內(nèi)皮素的表達(dá)，上述結(jié)果證明TSH對內(nèi)皮功能有保護(hù)作用。但是，另外一些實(shí)驗(yàn)證明了TSH可以引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和前列腺素I2(PGI2)表達(dá)的降低以及內(nèi)皮素和血漿纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）表達(dá)的增加，這證明了TSH對內(nèi)皮細(xì)胞存在破壞作用。目前關(guān)于TSH對促動脈粥樣硬化因子，如OPN、Integrinαvβ3以及VCA

5、M-1的直接影響尚沒有證據(jù)。本研究探討人群中TSH與動脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素的關(guān)系，探究亞臨床甲減對大鼠主動脈中OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1的影響，以及TSH對HUVEC上述因子的作用機(jī)制。
　　方法:1.本研究的對象來自于2014年中國醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所在沈陽市南站社區(qū)進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查。共有533人在2014年參與了調(diào)查，2015年對該人群中的440人進(jìn)行了隨訪，并簽署知情同意書，隨訪率為82.55％。最終共

6、有322人納入調(diào)查，年齡為40-69歲。按照2014年甲狀腺功能測定結(jié)果，診斷亞臨床甲減患者36人，甲狀腺功能正常者286人。排除標(biāo)準(zhǔn)為:未參加頸動脈超聲檢查;既往有甲狀腺疾病史;應(yīng)用影響甲狀腺功能的藥物，如甲狀腺激素或抗甲狀腺藥物等;經(jīng)2014年甲狀腺功能測定診斷為臨床甲減和臨床甲亢者;有腫瘤史、慢性腎病史、心梗史、腦梗死病史;重要信息缺失者。采集空腹靜脈非抗凝血分別檢測TSH、FT4、FT3、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、

7、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，頸動脈超聲檢測IMT。
　　2.30只雄性Wistar大鼠重約180-200g購自北京維通利華公司，正常喂養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為三組:亞臨床甲減組(SCH，n=10)，臨床甲減組(CH，n=10)以及正常對照組(CON，n=10)。CH以及SCH組大鼠進(jìn)行甲狀腺全切除術(shù)，建立臨床甲減模型。CON組大鼠給予甲狀腺切除的假手術(shù)但不切除甲狀腺。術(shù)后四周，SCH組大鼠給予皮下

8、注射L-T4每日0.95μg/100g，CH組以及CON組大鼠給予同等量的生理鹽水。術(shù)后大鼠均在飲水中給予0.1％(w/v)葡萄糖酸鈣并喂養(yǎng)正常飲食。所有血樣均立即13000轉(zhuǎn)離心10分鐘，長期儲存在-80℃。免疫化學(xué)發(fā)光法檢測大鼠血清TT4和TSH水平。分離大鼠主動脈組織，分成幾部分分別保存在-80℃或用于其他實(shí)驗(yàn)。Western Blot法檢測大鼠主動脈組織OPN、VCAM-1以及Integrinαvβ3蛋白的水平。免疫組化法檢測大

9、鼠主動脈內(nèi)皮OPN、VCAM-1以及Integrinαvβ3的水平并用ImagePro Plus軟件進(jìn)行分析。大鼠主動脈組織用2.5％戊二醛4℃固定，透射電鏡掃描進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。所有結(jié)果均有SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.HUVEC在無血清的ECM培養(yǎng)基中饑餓12小時后給予TSH刺激。給予HUVEC不同濃度TSH(0，0.1，1，10，100mIU/ml)24小時，或給予10 mIU

10、/ml TSH不同作用時間(0，2，6，12，24，48h)。Erk特異性抑制劑PD98059以及Akt特異性抑制劑LY294002給予HUVEC1小時后進(jìn)行TSH刺激。提取細(xì)胞全蛋白以及mRNA，Western Blot法檢測HUVEC中OPN、VCAM-1以及Integrinαvβ3蛋白的水平，Real-Time PCR法檢測HUVEC中OPN、 VCAM-1以及Integrinαvβ3 mRNA的表達(dá)。運(yùn)用透射電鏡觀察HUVEC的

11、超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果:1.應(yīng)用偏相關(guān)分析以及二元Logistic回歸，分析2014年TSH與頸動脈內(nèi)膜增厚的關(guān)系。校正年齡、吸煙、收縮壓、舒張壓、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血脂水平以及FT3、FT4后，TSH與頸動脈內(nèi)膜增厚呈正相關(guān)（B=0.196，P=0.031），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.應(yīng)用偏相關(guān)分析以及多元線性回歸分析2014年TSH與IMT的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡（B=0.005，P=0.000）、收縮壓水平（B=0.001，P=

12、0.016）、BMI（B=0.005，P=0.007）和IMT呈現(xiàn)正相關(guān)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按照年齡將人群分為三組，40-49歲，50-59歲，60-69歲，分別校正吸煙、性別、血壓水平、血脂水平、BMI水平，在60-69年齡組，TSH是IMT的危險(xiǎn)因素(B=0.015，P=0.020)，結(jié)果表明，TSH每升高1mIU/L，IMT值平均增厚0.015mm。3.給予L-T4注射四周后眶后靜脈采血，SCH組大鼠TT4升高接近正常水平，TS

13、H仍顯著高于CON組(P＜0.05），符合亞臨床甲減改變;CH組TSH仍然顯著升高，TT4低于CON組（P＜0.05），符合甲減改變。4.亞臨床甲減能夠上調(diào)大鼠主動脈組織中OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1蛋白的水平（P＜0.05），雖然甲減組OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1的蛋白水平較亞臨床甲減組高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.透射電鏡下，CON組大鼠的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)了完整的細(xì)胞膜和清晰的核膜，內(nèi)皮細(xì)胞

14、間連接緊密。SCH組大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞膜部分破壞和溶解，部分細(xì)胞核形異常，線粒體外膜模糊、嵴減少。CH組部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，彈力板裸露，一些細(xì)胞核型不規(guī)則并且呈現(xiàn)染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜溶解或一定程度的破壞。細(xì)胞質(zhì)中，一些細(xì)胞的線粒體空泡樣變，外膜破壞。6.在0到10mIU/ml濃度之間，HUVEC中OPN以及Integrinαvβ3的蛋白水平和mRNA表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴的形式。TSH濃度為10mIU/ml時，OPN和Integrinαvβ3的表

15、達(dá)量與對照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。7.在0到10mIU/ml濃度之間，HUVEC中VCAM-1的蛋白水平和mRNA表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴的形式。TSH濃度為1mIU/ml、10mIU/ml時，VCAM-1的表達(dá)量與對照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)。8.隨著TSH作用時間延長，VCAM-1的蛋白水平和mRNA表達(dá)升高，在0到24h之間，呈現(xiàn)時間依賴方式增長，在6h、12h和24h后VCAM-1的mRNA表達(dá)量分別是

16、對照組的1.49，1.67和2.02倍（P＜0.05）。9.隨著TSH作用時間延長，OPN的蛋白水平和mRNA表達(dá)升高，在6h、24h和48h后OPN的mRNA表達(dá)量分別是對照組的1.92，2.55和2.24倍（P＜0.05）。10.隨著TSH作用時間延長，Integrinαvβ3的蛋白水平和mRNA表達(dá)升高，在TSH作用24h后最顯著（P＜0.01）。與OPN的升高趨勢相一致，Integrinαvβ3的mRNA表達(dá)量在TSH作用6h，

17、24h和48h后是正常對照組的2.08，2.35，和1.76倍。11.透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，隨著TSH濃度以及作用時間延長，HUVEC的超微結(jié)構(gòu)改變逐漸加重。12.10 mIU/ml TSH作用于HUVEC不僅可以提高OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1的蛋白水平，也可以增加p-Akt的表達(dá)。進(jìn)一步使用Akt通路抑制劑LY294002，結(jié)果顯示LY294002可以顯著抑制TSH引起的OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1

18、表達(dá)水平升高（P＜0.05）。13.10 mIU/ml TSH作用于HUVEC不僅可以提高OPN，Integrinαvβ3以及VCAM-1的表達(dá)水平，也可以增加p-Erk的表達(dá)。使用Erk通路抑制劑PD98059，結(jié)果顯示PD98059不能夠抑制TSH引起的OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1蛋白水平升高。
　　結(jié)論:1.TSH與頸動脈內(nèi)膜增厚呈顯著正相關(guān)，在年齡為60-69歲的人群中，TSH是IMT增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素