拔毒生肌散的毒性特點(diǎn)及方中爐甘石對(duì)汞毒性的影響研究.pdf

1、應(yīng)用紅粉、輕粉、朱砂等含汞成分中藥及其制劑治療慢性難愈性皮膚潰瘍是中醫(yī)外科的特色之一。但因其含有汞、鉛等重金屬成分，加之沒有明確的使用劑量和周期，存在較大的安全性隱患，使該類傳統(tǒng)外用制劑的臨床應(yīng)用和推廣受到了限制。本研究選擇來源于古代外科名方“生肌散”的拔毒生肌散（Badu Shengji San，BDSJS）為代表藥物，研究其毒性特點(diǎn)，以為臨床安全用藥提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。目前，國內(nèi)對(duì)含汞外用制劑反復(fù)用藥后的毒性特點(diǎn)尚無報(bào)道。
　　

2、 國外最新研究發(fā)現(xiàn)ZnCl2對(duì)HgCl2引起的乳鼠腎損傷具有保護(hù)作用[1]。提示，鋅對(duì)汞誘發(fā)的腎損傷具有一定的保護(hù)作用。本課題前期研究已證明汞是BDSJS的主要毒性成分，腎臟是其主要毒性靶器官，且方中的配伍藥昧能夠減輕汞所致的腎損傷[2]。在配伍藥味中，爐甘石（煅）的主要成分是氧化鋅。由此我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)上進(jìn)行推論，認(rèn)為以鋅為主要成分的爐甘石可能是BDSJS中汞成分的減毒藥味?；谝陨险J(rèn)識(shí)，本研究以含汞成分的紅粉作為染毒藥物，觀察爐

3、甘石對(duì)破損皮膚大鼠腎損傷的影響，探討其對(duì)汞代謝方面的可能影響及其機(jī)制。目前，國內(nèi)對(duì)爐甘石及鋅降低汞毒性及其配伍減毒機(jī)制尚無報(bào)道。
　　 本論文包括兩個(gè)部分:BDSJS的毒性特點(diǎn)和方中爐甘石對(duì)汞毒性的影響。
　　 1 BDSJS的毒性特點(diǎn)研究
　　 1.1對(duì)破損皮膚大鼠反復(fù)給藥汞成分在體內(nèi)的蓄積情況研究
　　 目的：
　　 觀察BDSJS反復(fù)給藥后汞成分存大鼠體內(nèi)的蓄積情況，明確BDSJS的安全劑量

4、、用藥周期及毒性可逆程度。
　　 方法：
　　 采用破損皮膚大鼠模型，分別以高、中、低劑量的100、50、25mg/kg BDSJS涂敷于大鼠背部破損皮膚給藥區(qū)，敷藥后固定24h，每日給藥1次，連續(xù)給藥4周。檢測(cè)給藥4周、停藥4周及停藥8周大鼠血、尿、腎皮質(zhì)中的汞含量，觀察汞成分在破損皮膚大鼠體內(nèi)的蓄積情況，并以腎早期損傷指標(biāo)尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)和β2-微球蛋白（β2-M

5、G）含量、肝腎功能、凝血時(shí)間及腎組織形態(tài)學(xué)變化為腎毒性指標(biāo)，評(píng)價(jià)汞蓄積是否可造成腎組織的損傷及其嚴(yán)重程度。
　　 結(jié)果：
　　 與破損皮膚對(duì)照組比較，用藥4周BDSJS高、中、低劑量組大鼠的血汞、尿汞、腎汞含量均明顯升高，且升高呈劑量依賴性;停藥4周，BDSJS各組大鼠的血汞含量均已恢復(fù)至正常水平，尿汞含量下降80-90％，腎汞含量下降50％以上;停藥8周，BDSJS各組大鼠尿汞均恢復(fù)至正常水平，腎汞下降70％以上，但仍

6、有一定蓄積。
　　 BDSJS高劑量組給藥4周，在腎汞含量為（47.99±15.66）ng/g，血汞含量為（72.06±18.03）ng/g，尿汞含量為（1278.84±711.82）ng/mL時(shí)，大鼠出現(xiàn)腎臟系數(shù)和β2-MG含量的明顯升高，腎組織病理檢查見少數(shù)大鼠出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹;停藥4周，腎汞含量為（20.43±5.09）ng/g，尿汞含量為（82.70±25.83）ng/mL，血汞含量為（5.59±0.94）ng/m

7、L（基本恢復(fù)正常水平）時(shí)，腎臟系數(shù)、尿β2-MG及腎組織形態(tài)基本恢復(fù)正常;停藥8周，雖腎組織中汞仍有一定蓄積，含量為（18.60±12.35）ng/g，但尿β2-MG及腎組織形態(tài)恢復(fù)正常。中、低劑量組大鼠在給藥4周，血汞分別為（38.44±28.72）ng/g和(26.63±18.67)ng/g，尿汞分別為（380.80±119.32）ng/mL和(239.53±110.34)ng/mL，腎汞含量分別為(31.27±11.21)μg/g

8、和（11.93±3.12）μg/g，但腎臟系數(shù)及尿β2-MG未見明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 BDSJS連續(xù)外敷4周，可造成汞在破損皮膚大鼠血液及腎臟中的蓄積，主要蓄積在腎臟;血中汞的清除較快，停藥4周基本恢復(fù)到正常水平;停藥8周，BDSJS中、低劑量組大鼠尿汞恢復(fù)至正常水平，腎臟中汞的清除超過70％，但仍有一定蓄積;BDSJS高劑量100mg/kg可造成腎小管的輕度損傷，但其損傷是可逆的，停藥4周后可基本恢復(fù)，中劑量

9、50mg/kg為其安全劑量。
　　 1.2 BDSJS對(duì)慢性皮膚潰瘍患者汞成分在機(jī)體內(nèi)的蓄積情況研究
　　 目的
　　 采用動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)得出的安全劑量和用藥周期，觀察慢性下肢瘡瘍患者以BDSJS外敷治療4周及停藥后汞在體內(nèi)的蓄積情況，為制定臨床安全劑量和給藥周期提供依據(jù)。
　　 方法
　　 入組患者每日給藥1次，或視患者創(chuàng)面情況隔日換藥1次，以0.28mg/cm2/d的劑量治療4周，測(cè)定患者治療

10、前、治療4周、停藥2周及停藥6周的血汞及尿汞含量，并以血清ALT、AST、BUN、Cr、尿NAG及β2-MG為毒性觀察指標(biāo)，評(píng)價(jià)汞蓄積對(duì)患者肝、腎功能指標(biāo)的影響。
　　 結(jié)果
　　 外敷BDSJS治療慢性皮膚潰瘍，患者在用藥4周血汞含量為(8.10±14.81)ng/mL,尿汞含量為（11.51±17.75）ng/mL，與治療前比較，血汞含量有升高趨勢(shì)，尿汞含量明顯升高;停藥2周和停藥6周，患者血汞及尿汞含量未見明顯升高

11、。
　　 與治療前比較，治療4周、停藥2周及停藥6周，血清中ALT、AST、BUN、Cr及尿β2-MG含量未見明顯升高;治療4周，患者尿NAG含量明顯升高，停藥2周，尿NAG含量有升高趨勢(shì)，停藥6周，尿NAG含量未見明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 慢性難愈性下肢潰瘍患者20例，患處外敷BDSJS，以0.28mg/cm2/d劑量用藥4周，在患者尿中檢測(cè)到汞含量明顯升高，血汞含量有升高趨勢(shì);停藥6周，患者血汞及尿汞基本

12、恢復(fù)至正常水平。但治療期及停藥期BDSJS均未造成肝腎功能的明顯異常，提示，汞在機(jī)體內(nèi)短時(shí)間蓄積（血汞含量低于8.1 ng/mL，尿汞低于含量11.5ng/mL）不會(huì)導(dǎo)致腎損傷。該研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，動(dòng)物安全性實(shí)驗(yàn)得出的安全劑量和周期對(duì)臨床用藥具有指導(dǎo)作用。
　　 1.3對(duì)不同皮膚損傷條件大鼠的腎毒性差異
　　 目的
　　 比較BDSJS對(duì)不同皮膚損傷條件大鼠的腎毒性差異。
　　 方法
　　 采用

13、BDSJS的毒性劑量，以腎臟系數(shù)、尿RBP、NAG含量及腎組織的病理形態(tài)為腎毒性觀察指標(biāo)，比較其對(duì)破損皮膚和瘡瘍皮膚兩種不同皮膚損傷條件大鼠的腎毒性差異。
　　 結(jié)果
　　 與破損皮膚對(duì)照組比較，破損皮膚+BDSJS240mg/kg組大鼠的尿NAG、RBP含量明顯升高，破損皮膚+BDSJS120mg/kg組大鼠的尿NAG、RBP含量有升高趨勢(shì)，但未見顯著性差異。
　　 與潰瘍皮膚組比較，潰瘍皮膚+BDSJS240

14、及潰瘍皮膚+BDSJS120mg/kg組大鼠的尿NAG、RBP含量均見明顯升高。
　　 與相同給藥劑量的破損皮膚組大鼠比較，瘡瘍皮膚模型大鼠給予BDSJS240mg/kg與120mg/kg，大鼠的腎臟系數(shù)、尿RBP含量均明顯升高，腎組織病理學(xué)檢查見腎小管擴(kuò)張及上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、脫落或呈空泡變等明顯病變。
　　 結(jié)論
　　 相同給藥劑量下，BDSJS對(duì)瘡瘍皮膚大鼠的腎毒性高于其對(duì)破損皮膚大鼠的腎毒性。提示，臨床應(yīng)用

15、含汞制劑應(yīng)高度重視創(chuàng)面深度對(duì)藥物吸收和汞蓄積的影響。
　　 2爐甘石對(duì)BDSJS中汞成分毒性的影響
　　 2.1爐甘石對(duì)紅粉所致破損皮膚大鼠腎毒性的影響
　　 目的
　　 探討爐甘石對(duì)破損皮膚大鼠汞染毒所致腎損傷有無保護(hù)作用。
　　 方法
　　 采用破損皮膚大鼠模型，以BDSJS的紅粉作為汞染毒藥物，以腎臟系數(shù)、尿NAG、RBP含量及腎病理組織形態(tài)學(xué)為毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討爐甘石對(duì)汞引起的腎毒

16、性是否具有減毒作用。
　　 結(jié)果
　　 與破損皮膚對(duì)照組比較，連續(xù)給藥2周，紅粉24mg/kg(累計(jì)劑量336mg/kg)劑量組大鼠的腎臟系數(shù)和尿NAG、RBP含量明顯升高;等劑量爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)、尿NAG、RBP含量均無明顯改變;紅粉+爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)及尿NAG含量明顯升高，RBP含量有升高趨勢(shì);與等劑量的紅粉組比較，紅粉+爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)有降低趨勢(shì)。
　　 與破損皮膚對(duì)照組比較，給藥1周，紅

17、粉20mg/kg(累計(jì)劑量140mg/kg)可導(dǎo)致大鼠的腎臟系數(shù)明顯升高，尿NAG有升高趨勢(shì)，紅粉+爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)明顯升高，尿NAG含量有下降趨勢(shì)。與等劑量的紅粉組比較，紅粉+爐甘石組大鼠腎臟系數(shù)有降低趨勢(shì)，NAG含量明顯下降。
　　 結(jié)論:爐甘石對(duì)汞具有一定的減毒作用，但其減毒作用與汞的用量及使用周期有關(guān)。
　　 2.2爐甘石對(duì)汞代謝的影響
　　 目的
　　 探討爐甘石對(duì)汞代謝的影響及其機(jī)制。<

18、br>　　 方法
　　 以破損皮膚大鼠為模型，以BDSJS中的紅粉為汞染毒藥物，測(cè)定血汞、尿汞、腎汞含量，采用頸動(dòng)脈插管技術(shù)，觀察不同時(shí)間點(diǎn)血汞濃度的變化，同時(shí)采用超濾法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率，以探討爐甘石對(duì)血汞吸收、腎汞蓄積、尿汞排泄的影響及其機(jī)制;以GSH、MDA、T-SOD、Cu-ZnSOD及ATP含量為指標(biāo)，觀察爐甘石對(duì)破損皮膚大鼠汞染毒大鼠自由基代謝的影響。
　　 結(jié)果
　　 血、尿、腎組織的汞含量:紅粉

19、24mg/kg連續(xù)用藥2周（累計(jì)劑量336mg/kg）及20mg/kg用藥1周(累計(jì)劑量140mg)，可造成破損皮膚大鼠血汞、尿汞及腎汞含量升高;紅粉累計(jì)劑量336mg/kg時(shí)，等劑量的爐甘石對(duì)紅粉組大鼠的血汞、尿汞、腎汞含量無明顯影響;紅粉累積劑量為140mg/kg時(shí)，等劑量的爐甘石可使紅粉組大鼠血汞含量下降，尿汞、腎汞含量有升高趨勢(shì)。
　　 不同時(shí)間點(diǎn)爐甘石對(duì)血汞濃度的影響:單次給藥后，紅粉組及紅粉+爐甘石組大鼠的血汞濃度逐

20、漸增加，紅粉組大鼠去藥8h血汞濃度達(dá)到最高值;爐甘石組大鼠去藥4h血汞達(dá)到最高值，此后血汞水平逐漸下降。
　　 血漿蛋白結(jié)合率:在大鼠及正常人血漿中，與汞25ng/L組比較，汞25ng/L+鋅組的血漿蛋白結(jié)合率有下降趨勢(shì);在人血清白蛋白(HSA)中，與汞25ng/L組比較，汞25ng/L+鋅組的血漿蛋白的結(jié)合率明顯下降。提示，在低劑量范圍內(nèi)，鋅可能通過與汞競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合白蛋白，降低汞的血漿蛋白結(jié)合率。
　　 對(duì)自由基代謝的影響

21、:與破損皮膚對(duì)照組比較，紅粉20mg/kg組大鼠腎組織的MDA水平和Na+K+-ATPase活力水平明顯升高，SOD、GSH水平未見明顯改變;與紅粉組比較，紅粉+爐甘石組大鼠的腎組織MDA水平和Na+K+-ATPase活力水平明顯下降，T-SOD及Cu-ZnSOD水平有升高趨勢(shì)，GSH無明顯改變。
　　 結(jié)論
　　 爐甘石對(duì)汞具有一定的減毒作用，其機(jī)制可能是通過競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制降低汞與血漿白蛋白的結(jié)合，從而降低血汞濃度，加速尿汞

22、排泄;同時(shí)鋅還可通過降低汞引起大鼠腎組織MDA含量、提高SOD含量，參與自由基的代謝，保護(hù)腎組織的氧化損傷而發(fā)揮減毒作用。
　　 2.2鋅對(duì)腎小管上皮細(xì)胞汞毒性損傷的影響
　　 目的
　　 從體外角度探討鋅對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）汞毒性損傷的作用及其機(jī)制。
　　 方法
　　 以氯化汞(HgCl2)及氯化鋅(ZnCl2)作為汞離子和鋅離子的供體，采用MTT及LDH釋放率法篩選HgCl2和Z

23、nCl2的作用濃度，并以此為基礎(chǔ)借助高內(nèi)涵成像分析技術(shù)，以細(xì)胞數(shù)、DNA含量、線粒體膜電位及細(xì)胞膜通透性為指標(biāo)，探討不同劑量的鋅對(duì)汞染毒HK-2細(xì)胞的毒性作用。
　　 結(jié)果
　　 與對(duì)照組細(xì)胞比較，HgCl210、20、30μmol/L能夠明顯降低細(xì)胞數(shù)、增加DNA含量、線粒體膜電位、細(xì)胞膜通透性，并具有劑量依賴性;HgCl20.01μmol/L可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞的膜電位明顯升高，對(duì)DNA含量、細(xì)胞數(shù)及通透性均無明顯影響

24、;ZnCl20.1μmol/L對(duì)HK-2細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)、DNA含量、線粒體膜電位及通透性均無明顯影響。
　　 與對(duì)照組細(xì)胞比較，ZnCl210、20μmol/L能夠明顯抑制HgCl210、20μmol/L引起的DNA含量的異常增高，增強(qiáng)細(xì)胞線粒體膜電位及通透性的增高;HgCl20.01μmol/L+ZnCl20.1μmol/L可致細(xì)胞數(shù)明顯下降，細(xì)胞線粒體膜電位和膜通透性明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 HgCl2可造