伊氏錐蟲ELISA方法的建立及廣西水牛伊氏錐蟲感染的初步調(diào)查.pdf

1、伊氏錐蟲病是一種有廣泛寄主的動物原蟲病，所有哺乳動物都易感。在我國南方主要感染牛(特別水牛)，大多數(shù)牛感染伊氏錐蟲后能直接引起個體的急性死亡或隱性感染，造成貧血，進(jìn)行性消瘦、死胎、流產(chǎn)，泌乳減少等。是我國畜牧業(yè)特別是養(yǎng)牛業(yè)的一大障礙。由于蟲體頻繁的抗原變異，至今沒有成功的疫苗問世。所以該病的控制還是以藥物為主。但由于該病在牛體內(nèi)大多呈慢性經(jīng)過，蟲血癥起伏，難于及早發(fā)現(xiàn)。所以采用合適的監(jiān)測方法及早進(jìn)行診斷和對畜群進(jìn)行血清學(xué)預(yù)測，才能及早用

2、藥，及時控制該病的擴(kuò)散。 本試驗(yàn)首先用伊氏錐蟲湖北水牛單克隆蟲株10<'7>條耳靜脈感染1只新西蘭大白兔，每三天采血分離一個錐蟲群體并進(jìn)行單蟲克隆，最后一個未克隆群體再感染另一只兔子，同上方法收集變異體，依次感染四只兔子，共收集到40個錐蟲克隆群體。同時制備相應(yīng)的40個抗錐蟲單價血清。將40個克隆群體與40個抗血清進(jìn)行IFA交叉血清學(xué)檢測，鑒定為19個不同的抗原變異型。經(jīng)IFA試驗(yàn)檢測篩選到兩個變異體HbTatl1.18和HbT

3、at1.15能與多數(shù)異源克隆錐蟲血清反應(yīng)產(chǎn)生較強(qiáng)的藍(lán)綠色熒光。 利用混合蛋白酶抑制劑結(jié)合超高速逐級離心的方法成功分離、純化了一株變異體HbTat1.18的表面糖蛋白(VSG)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析所提VSG較純，分子大小約為63.5KD。 利用經(jīng)IFA鑒定的變異型HbTat1.18潛在的特殊抗原性，提取HbTat1.18的可溶性抗原作為包被抗原，建立了檢測伊氏錐蟲抗體的間接ELISA方法，并對ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)

4、行了探索，確定抗原的最適包被濃度為2.59μg/ml，檢測血清稀釋為400倍稀釋，血清與抗原的最佳反應(yīng)時間為1.5h，酶標(biāo)二抗最佳作用時間為1h，底物的最佳顯色時間為20min。采用已確立的ELISA反應(yīng)條件，檢測了26份已檢測判定為陰性的水牛血清。依據(jù)陰陽臨界值=陰性血清OD平均值+3SD，確定陰陽臨界值為0.227。用此方法檢測包被的抗原不與在牛感染率高的片形吸蟲的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，對實(shí)驗(yàn)感染的水牛抽測的16份血清多次測定100

5、％呈陽性，對8份陰性血清多次測定100％呈陰性，初步認(rèn)為該ELISA方法具有良好的特異性。 應(yīng)用建立的ELISA方法觀察了實(shí)驗(yàn)感染伊氏錐蟲水牛的抗體消長情況以及對廣西部分地區(qū)的水牛進(jìn)行了血清流行病學(xué)的初步調(diào)查。對采自廣西部分地區(qū)的79份水牛血清的檢測，結(jié)果有23份呈陽性，陽性率達(dá)29.1％。 本試驗(yàn)篩選到有特殊抗原性的變異體HbTat1.18和HbTat1.15，其中用變異型HbTat1.18的可溶性蛋白作包被抗原成功建