錐蟲亞屬種間進(jìn)化和分子鑒定及SSAO介導(dǎo)的錐蟲致死作用.pdf

1、錐蟲亞屬三個種：布氏錐蟲、伊氏錐蟲和馬媾疫錐蟲分別引起家畜的那加那病、蘇拉病和媾疫病，給疫區(qū)國家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是家畜業(yè)最重要的寄生蟲病之一。 關(guān)于伊氏錐蟲和馬媾疫錐蟲的起源以及錐蟲亞屬三個種之間的進(jìn)化關(guān)系還存在眾多爭議。本論文采用MGE-，SSR-和RAPD-PCR三種分子標(biāo)記技術(shù)研究了分離自中國、非洲和南美洲的18個錐蟲蟲株(包括5株布氏錐蟲、10株伊氏錐蟲和3株馬媾疫錐蟲)之間的遺傳相似性。利用三種分子標(biāo)記技術(shù)，在所有

2、18個蟲株中共獲得890多條典型條帶片段，片段大小介于0.2kb到2kb之間，每個蟲株獲得的典型條帶數(shù)介于39條到59條之間。每兩蟲株之間的遺傳相似系數(shù)(SC)從～41％到～94％不等，平均相似系數(shù)為～65％，同布氏錐蟲和馬媾疫錐蟲相比，伊氏錐蟲內(nèi)部的遺傳相似度最高，平均遺傳相似系數(shù)為～79％，而前兩者分別為～59％和～65％。根據(jù)各蟲株之間的遺傳相似系數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示，如果不考慮種的因素，絕大多數(shù)分離自中國和南美洲的蟲株聚類

3、于同一個進(jìn)化枝，而幾乎所有來自非洲的蟲株單獨(dú)成簇(除布氏錐蟲AnTat2.1株外)，因此，盡管伊氏錐蟲和布氏錐蟲有各自單獨(dú)成簇的趨勢，利用該三種分子標(biāo)記并不能明確區(qū)分三種錐蟲。研究結(jié)果支持伊氏錐蟲和馬媾疫錐蟲均源自變異的布氏錐蟲，而伊氏錐蟲源于馬媾疫錐蟲突變株的假說。此外，本論文還探討了地理因素對錐蟲亞屬內(nèi)各種間進(jìn)化的影響。 迄今為止，錐蟲亞屬三個種之間的分子鑒別還是一個難題，給從事該領(lǐng)域研究的寄生蟲學(xué)家造成很大的困惑，而該三種

4、錐蟲最為明顯的分子差別應(yīng)為動基體DNA(包括大環(huán)和小環(huán))的差異。本論文的另一個研究目的是根據(jù)布氏錐蟲動基體大環(huán)DNA序列設(shè)計(jì)特異的PCR引物反應(yīng)來鑒別布氏錐蟲、伊氏錐蟲和馬媾疫錐蟲并評估其在野外診斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值。我們根據(jù)布氏錐蟲動基體大環(huán)DNANADH脫氫酶亞單位5(ND5)設(shè)計(jì)的引物對9株布氏錐蟲(包括7株指名亞種和2株羅得西亞亞種)、10株伊氏錐蟲、5株馬媾疫錐蟲、2株活潑錐蟲及1株剛果錐蟲進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，同時采用錐蟲亞屬特異

5、的TBR-PCR作為錐蟲基因組質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明從所有布氏錐蟲和馬媾疫錐蟲蟲株中都可以擴(kuò)增出～395bp的目標(biāo)片段，而所有伊氏錐蟲、活潑錐蟲、剛果錐蟲及宿主DNA均顯示陰性結(jié)果。利用該P(yáng)CR方法可以快速將布氏錐蟲和馬媾疫錐蟲從伊氏錐蟲中區(qū)分開來，其檢測靈敏度為20-25條蟲/PCR反應(yīng)(用基因組DNA或處理過的感染錐蟲的血液樣品)。在此基礎(chǔ)上，我們分析了該方法的可靠性，并探討了動基體DNA差異在錐蟲亞屬種間進(jìn)化上的反映。 氨基脲

6、敏感的胺氧化酶(SSAO)廣泛分布于血管平滑肌細(xì)胞膜、脂肪細(xì)胞以及血液中，該酶介導(dǎo)其內(nèi)源性底物甲胺的脫氨基作用，產(chǎn)生甲醛和過氧化氫。近來的研究表明體內(nèi)SSAO的含量同一系列疾病(如糖尿病、心血管疾病、阿爾茨默氏病)密切相關(guān)，因此對其研究越來越受重視。在本論文中我們檢測了人臍帶動脈粗提物、山羊血清、兔血清、胎牛血清和小鼠血清中的SSAO活性，并分析了它們介導(dǎo)的甲胺脫氨基作用對布氏錐蟲的細(xì)胞毒影響，結(jié)果表明該酶在其底物甲胺濃度高于10-4M

7、時對培養(yǎng)的錐蟲具有明顯的細(xì)胞毒性，該毒性作用可以被SSAO的抑制劑氨基脲或MDL-72974A消除，因此我們認(rèn)為該毒性作用是由SSAO介導(dǎo)的甲胺脫氨基所產(chǎn)生的甲醛和過氧化氫導(dǎo)致的，而我們的實(shí)驗(yàn)也表明甲醛和過氧化氫對錐蟲的生長具有明顯毒性，其半數(shù)致死濃度均為～10-5M，這是SSAO介導(dǎo)殺錐蟲甚至其他微生物的主要機(jī)制。此外我們分析發(fā)現(xiàn)山羊、兔、牛和小鼠四種動物血清中SSAO活性與錐蟲感染蟲血癥水平之間密切相關(guān)，因此，我們認(rèn)為“SSAO-甲